阿特拉津氯水解酶定向進(jìn)化與AtGSTZ包涵體消融原因分析.pdf

1、定向進(jìn)化技術(shù)是應(yīng)用不同的技術(shù)手段對基因進(jìn)行人為改造，并且對符合人們意愿的RNA、蛋白或表達(dá)元件進(jìn)行篩選的一門科學(xué)。在過去的幾十年中，定向進(jìn)化作為一種強(qiáng)大的技術(shù)平臺強(qiáng)有力的托起了蛋白質(zhì)改造這一偉大工程。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用以及高通量篩選技術(shù)的出現(xiàn)，它的作用日益突出。在本文的研究中，我們首先將定向進(jìn)化技術(shù)應(yīng)用到阿特拉津氯水解酶(AtzA)上。
　　阿特拉津氯水解酶近幾年已經(jīng)引起了越來越多人們的關(guān)注，因?yàn)樗軐⒂卸镜陌⑻乩蜣D(zhuǎn)變

2、為無毒的羥基阿特拉津。由于它自身的這種優(yōu)勢，所以可用來降解環(huán)境中有毒的阿特拉津。正是看中這種特質(zhì)，本研究對阿特拉津氯水解酶進(jìn)行了定向進(jìn)化，以期望得到酶活力提高的突變子，從而為環(huán)境中阿特拉津的生物降解提供試驗(yàn)材料。但是，阿特拉津氯水解酶在大腸桿菌(E.coli)中以包涵體的形式存在，這大大限制了大腸桿菌在篩選體系中的作用。為了克服這種障礙，本研究利用一種基于雨生紅球藻的高通量篩選方法，在隨機(jī)突變文庫中成功篩選到了8個(gè)活力提高的突變體，并對

3、它們進(jìn)行了酶比活力及動力學(xué)參數(shù)的測定。它們的比活力提高顯著，是野生型的2.7到5.0倍，而且催化效率(kcat/Km)也提高至野生型的2.5至4.1倍。序列分析顯示，酶活力提高最明顯的兩個(gè)突變體(10-7、21-1)為單氨基酸替換突變子，這表明其替換位點(diǎn)Val12或Leu395對酶功能的發(fā)揮有重要作用。共同擁有四個(gè)相同氨基酸替換的突變子(48-6、32-2、7-10)的獲得也表明這四個(gè)氨基酸位點(diǎn)(M315、H399、N429、V466)

4、也是十分重要的。通過對以6個(gè)同源蛋白為模板建立的三維模型的分析及配體位置及結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測，發(fā)現(xiàn)AtzA具有氨基水解酶家族典型的（β/α）8結(jié)構(gòu)域及一個(gè)雙β-sheet結(jié)構(gòu)域。本研究確定了鐵離子的空間位置及與之結(jié)合的五個(gè)氨基酸位點(diǎn)，指出與配體及底物結(jié)合的位點(diǎn)位于（β/α）8結(jié)構(gòu)域中由8個(gè)β-strand組成的桶狀核心內(nèi)。此外，本研究通過分析突變位點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu)分布，認(rèn)為臨近（β/α）8結(jié)構(gòu)域的β-sheet內(nèi)的突變顯著影響酶活性，這種影響可

5、能是由于其整體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的改變所致。
　　利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白時(shí)，往往形成沒有活性的包涵體，這一問題一直制約著生物制藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展及重組蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)，也為本實(shí)驗(yàn)阿特拉津氯水解酶進(jìn)化子的篩選及酶活力的測定設(shè)置了障礙。為了了解包涵體形成的原因及其與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系，也為了對能夠降解環(huán)境中阿特拉津的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶有更進(jìn)一步的認(rèn)識，本研究借助于蛋白晶體結(jié)構(gòu)更為明晰的擬南芥Zeta類谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(AtGSTZ)進(jìn)行包

6、涵體形成的機(jī)理探索。利用易錯PCR(EP-PCR)和DNA洗牌(DNAshuffling)相結(jié)合的定向進(jìn)化方法對擬南芥Zeta類谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶Ser73不溶突變子(S73F、S73L、S73K、S73R)進(jìn)行改造，最終篩選到11個(gè)使包涵體消融的可溶突變子，并對其進(jìn)行了酶比活力及動力學(xué)參數(shù)的測定。其中5個(gè)源自親本S73R，3個(gè)源自親本S73K，2個(gè)源自S73L，1個(gè)源自親本S73F，這顯示不同Ser73不溶突變子的恢復(fù)能力不同。溶解性