高效液相色譜-光電二極管陣列檢測(cè)器法同時(shí)測(cè)定柿蒂中烏索酸和齊墩果酸含量

1、<p>　　高效液相色譜-光電二極管陣列檢測(cè)器法同時(shí)測(cè)定柿蒂中烏索酸和齊墩果酸含量</p><p>　　【摘要】 目的采用超聲輔助提取，建立高效液相色譜-光電二極管陣列檢測(cè)法測(cè)定柿蒂中烏索酸和齊墩果酸的含量。方法 色譜柱為Kromasil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇∶水∶磷酸（體積比87∶13∶0.1），流速0.8 ml·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)21

2、0 nm，柱溫28 ℃。結(jié)果烏索酸進(jìn)樣量在0.359～5.744 μg時(shí)，與峰面積呈良好的線性關(guān)系（r=0.999），平均回收率為98.3 %， RSD為2.0 %(n=6)；齊墩果酸在0.174～2.784 μg時(shí)，與峰面積呈良好的線性關(guān)系（r=0.999），平均回收率為99.6 %，RSD為2.5 %(n=6)。結(jié)論 方法操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，可用于柿蒂中烏索酸和齊墩果酸含量的測(cè)定。 </p><p>　　【

3、關(guān)鍵詞】 反相高效液相色譜法 柿蒂 烏索酸 齊墩果酸 光電二極管陣列檢測(cè)器</p><p>　　Abstract：ObjectiveTo develop an HPLC method with photodiode array detector(PAD) for the determination of ursolic acid and oleanolic acid in Diospyros kaki by u

4、ltrasowithnic wave aided method. MethodsThe separation was achieved on a Kromasil C18 column (4.6 mm×250 mm, 5 μm) at 28 ℃ using methanol-H2O-phosphoric acid (87∶13∶0.1,V/V) as the mobile phase at a flow rate of 0.8

5、 ml·min-1, the detection wavelength was 210 nm. ResultsUrsolic acid showed good relationship at the range of 0.359～5.744 μg (</p><p>　　Key words:HPLC; Diospyros kaki; Ursolic acid; Oleanolic acid

6、; Photodiode array detector</p><p>　　柿蒂Diospyros kaki Thunb.，別名為柿丁，為柿科植物柿的干燥花萼，主產(chǎn)于四川、廣東、廣西、福建等地。其味苦、性溫，有降氣止呃功能，常用于胃寒氣滯的呃逆。臨床治療頑固性或術(shù)后呃逆，反流性胃炎等癥［1］?！吨袊?guó)藥典》2005版僅有柿蒂中沒(méi)食子酸的薄層鑒別方法，而無(wú)含量測(cè)定項(xiàng)［2］。文獻(xiàn)報(bào)道了高效液相色譜測(cè)定柿蒂中沒(méi)食子酸

7、［3］,金絲桃苷和齊墩果酸等［4］有效成分含量的方法，但同時(shí)測(cè)定柿蒂中烏索酸和齊墩果酸含量的文獻(xiàn)至今未見(jiàn)報(bào)道。本文采用超聲輔助提取，建立高效液相色譜法對(duì)柿蒂中的烏索酸與齊墩果酸的含量進(jìn)行了測(cè)定，為柿蒂的質(zhì)量評(píng)價(jià)及其有效成分的檢測(cè)提供科學(xué)依據(jù)。</p><p><b>　　1 材料與試劑</b></p><p>　　Waters高效液相色譜儀（515泵，2996光電二

8、極管矩陣檢測(cè)器，7725I 進(jìn)樣閥，Empower 中文色譜工作站），RO-MB-10D高純水機(jī)(杭州永潔達(dá)膜分離設(shè)備廠)，CP225D分析天平（德國(guó)Sartorius公司），F(xiàn)W100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)，202-26A型數(shù)顯電熱恒溫干燥箱(上海陽(yáng)光實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)，KS-1500超聲提取儀器(寧波科盛儀器廠)。</p><p>　　甲醇為色譜純（色譜純，上海陸忠試劑廠），水為高純水，

9、95%乙醇（分析純，江西同盟試劑化工廠），烏索酸和齊墩果酸對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110742-200314，110709-200304，供含量測(cè)定用）。柿蒂購(gòu)于藥材市場(chǎng)，經(jīng)鑒定為柿科植物柿的干燥花萼Diospyros kaki Thunb.。</p><p><b>　　2 方法與結(jié)果</b></p><p>　　2.1 色譜條件</p&g

10、t;<p>　　色譜柱為Kromasil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇∶水∶磷酸（體積比87∶13∶0.1）；流速0.8 ml·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；柱溫為28℃。外標(biāo)法定量分析，烏索酸和齊墩果酸理論塔板數(shù)大于13 500，分離度分別為1.83和1.99，拖尾因子分別為1.01和1.04。對(duì)照品和樣品色譜見(jiàn)圖1。</p><p>　　

11、2.2 峰純度分析</p><p>　　從光電二極管檢測(cè)器采集的樣品三維圖譜中提取紫外光譜和不同波長(zhǎng)的色譜進(jìn)行對(duì)比，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm時(shí)色譜峰信噪比高，峰形對(duì)稱，分離度達(dá)到色譜方法的定量要求［5］。采用Empower色譜軟件適應(yīng)性模塊對(duì)此波長(zhǎng)的色譜峰進(jìn)行純度分析，對(duì)照品和樣品中烏索酸和齊墩果酸色譜峰的純度角值均小于閾值，純度角線均位于自動(dòng)閾值線下方，證實(shí)色譜峰為單一組分吸收峰。烏索酸和齊墩果酸的色譜峰純度分

12、析見(jiàn)圖2。</p><p><b>　　2.3 溶液配制</b></p><p>　　2.3.1 對(duì)照品溶液</p><p>　　分別精密稱定烏索酸、齊墩果酸對(duì)照品3.59 mg和1.74 mg，置于10 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成對(duì)照品混合溶液，備用。</p><p>　　2.3.2 樣品溶液

13、 </p><p>　　取于80 ℃干燥并粉碎過(guò)20目篩的柿蒂粉末約3 g，分別置于50 ml具塞錐形瓶中，用95 ％乙醇40 ml超聲提取90 min，過(guò)濾，殘?jiān)靡掖枷礈?，合并濾液，定容至50 ml量瓶中，搖勻，作為樣品溶液。</p><p>　　2.4 線性關(guān)系試驗(yàn)</p><p>　　分別精密吸取烏索酸和齊墩果酸對(duì)照品混合溶液中1，4，8，12，16 μ

14、l進(jìn)樣分析，按色譜條件測(cè)定峰面積，以對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積(μV·s)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性擬合，得烏索酸線性回歸方程為：Y=6.44×105X-5.83×104（r=0.999），齊墩果酸線性回歸方程為：Y=7.54×105X-3.70×104(r=0.999)。表明當(dāng)烏索酸進(jìn)樣量在0.359～5.744 μg；齊墩果酸進(jìn)樣量在0.174～2.784 μg時(shí)，線性關(guān)系良好。&

15、lt;/p><p>　　2.5 精密度實(shí)驗(yàn)</p><p>　　分別精密吸取烏索酸和齊墩果酸對(duì)照品混合溶液10 μl進(jìn)樣，平行5次，測(cè)定峰面積。烏索酸和齊墩果酸峰面積RSD分別為0.2 %(n=5)和0.6 %(n=5)。表明進(jìn)樣方法和儀器精密度良好。</p><p>　　2.6 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)</p><p>　　取同批柿蒂樣品5份，每份各約3

16、 g，按樣品溶液制備方法制備樣品溶液。精密吸取各樣品溶液10 μl，進(jìn)樣，測(cè)定烏索酸和齊墩果酸峰面積，外標(biāo)法計(jì)算含量。烏索酸含量RSD為1.8 %（n=5），齊墩果酸含量RSD為2.3 %（n=5）。樣品處理方法重現(xiàn)性良好。</p><p>　　2.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn)</p><p>　　精密稱取已知烏索酸和齊墩果酸含量的柿蒂葉樣品6份，每份約3 g，按高、中、低3種濃度分別加入烏索酸和

17、齊墩果酸對(duì)照品適量，制備樣品溶液，進(jìn)樣測(cè)定樣品中烏索酸和齊墩果酸的含量。烏索酸平均加樣回收率為98.3%，RSD為2.0 %（n=6）；齊墩果酸平均回收率為99.6 %，RSD為2.5 %（n=6）。</p><p>　　2.8 樣品含量測(cè)定 </p><p>　　精密吸取不同的柿蒂樣品溶液10 μl進(jìn)樣，平行3次，測(cè)定烏索酸和齊墩果酸峰面積積分值，外標(biāo)法計(jì)算柿蒂樣品中烏索酸和齊墩果酸

18、的平均含量。結(jié)果見(jiàn)表1。表1 柿蒂不同部位中烏索酸和齊墩果酸含量測(cè)定結(jié)果（略）</p><p><b>　　3 討論</b></p><p>　　測(cè)定結(jié)果表明，不同柿蒂樣品中兩種三萜酸成分的含量較高，為藥材的主要活性成分。但烏索酸和齊墩果酸含量存在差異，且烏索酸含量均明顯高于齊墩果酸，約為齊墩果酸的2.8～2.9倍，2組分含量的相對(duì)值基本穩(wěn)定。</p>

19、<p>　　考察了Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Nucleodur C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）和Nova-Pak C18（3.9 mm×300 mm，4 μm）3種色譜柱對(duì)同分異構(gòu)體烏索酸和齊墩果酸的分離效果，結(jié)果顯示不同型號(hào)色譜柱對(duì)烏索酸和齊墩果酸的分離度有較大的影響，Kromasil柱的分離效果最佳，烏索酸和齊墩果酸達(dá)基線分離，分離度

20、為1.9，符合色譜定量分析的要求。</p><p>　　采用反相高效液相色譜法測(cè)定柿蒂中的烏索酸和齊墩果酸的含量，樣品處理簡(jiǎn)單，無(wú)其它雜質(zhì)的干擾，可同時(shí)檢測(cè)待測(cè)組分的峰純度和紫外吸收特征光譜，增強(qiáng)了色譜的定性能力，方法簡(jiǎn)便、快速，分離效果好，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。</p><p><b>　　【參考文獻(xiàn)】</b></p><p>　?。?］肖培根.新編

21、中藥志（第二卷）［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2002：487.</p><p>　　［2］國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典，Ⅱ部［S］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：175.</p><p>　?。?］王 初,胡曉煒,宋旭峰.反相高效液相色譜法測(cè)定柿蒂中沒(méi)食子酸的含量［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2005，24(8)：728.</p><p>　?。?］鄭一敏,胥秀英,楊艷紅,等.