典型有機磷和擬除蟲菊酯對PC12細胞毒性的氧化應激機制及對映體選擇性.pdf

1、近幾年來，一些科研工作者對手性農(nóng)藥的環(huán)境安全性進行了研究，并發(fā)現(xiàn)手性農(nóng)藥在環(huán)境歸趨、內分泌干擾、生殖毒性以及免疫毒性等方面均具有對映體選擇性。然而，到目前為止對單（一）對映異構體引起的毒性作用的分子機制的研究還比較有限。為了更為準確地評估手性農(nóng)藥的環(huán)境風險性，有必要開展典型手性農(nóng)藥的環(huán)境風險性評價，并深入研究對映體選擇性毒性的分子機制。因此，本文主要以丙溴磷和聯(lián)苯菊酯為手性有機磷和擬除蟲菊酯的代表，以大鼠嗜鉻細胞瘤株(PC12)細胞作為

2、體外細胞模型，在細胞和分子水平上研究由氧化應激介導的有機磷和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥對PC12細胞的毒性機制及對映體差異性。研究主要取得以下結果:
　　 (1)以典型手性擬除蟲菊酯聯(lián)苯菊酯(BF)為研究對象，考察了cis-BF引起PC12細胞細胞毒性和氧化應激的對映體差異性。實驗結果顯示，當濃度為10-5molL-1及以上時，cis-BF對PC12細胞的毒性效應及氧化應激存在顯著的對映體選擇性差異，對映體1S-cis-BF的作用明顯強于

3、對映體1R-cis-BF.1S-cis-BF可以更顯著性地抑制PC12細胞活性，誘導細胞外乳酸脫氫酶(LDH);同時1S-cis-BF使PC12細胞內活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)水平明顯升高，細胞內超氧化物歧化酶(SOD)活性受到顯著抑制。可見，cis-BF可以對映體特異性地誘導細胞毒性以及氧化應激，并且1S-cis-BF是其引起細胞毒性和氧化應激的主要貢獻者。
　　 (2)在得到了cis-BF可以對映體選擇性地誘導氧化應

4、激的結果的基礎上，采用熒光定量PCR(qRT-PCR)法進一步深入研究了cis-BF對氧化應激以及熱休克蛋白相關基因表達的影響及對映體選擇性。研究結果顯示，當濃度大于5×10-6molL-1時，1S-cis-BF可以顯著性地誘導HSP90、HSP70、HSP60、Cu-ZnSOD、MnSOD、CAT以及GST基因表達上調，而1R-cis-BF對相關基因表達的影響明顯弱于1S-cis-BF。1S-cis-BF對Cu-ZnSOD、MnSOD

5、、GST和CAT基因表達的誘導可能主要是通過激活p38通路和ERK通路，對HSP90、HSP70和HSP60基因表達的誘導主要是通過激活p38通路。
　　 (3)以丙溴磷作為手性有機磷農(nóng)藥的代表，在對映體層面上研究丙溴磷由氧化應激介導的PC12細胞的細胞毒性的機制及對映體差異性。MTT、LDH和彗星實驗的結果顯示，丙溴磷外消旋體及其對映體對細胞活性、LDH釋放以及細胞彗尾長度的影響具有劑量和時間依賴性，對映體(-)-丙溴磷的毒性

6、明顯高于(+)-丙溴磷和rac-丙溴磷。㈠-丙溴磷可以劑量和時間依賴性刺激ROS和MDA產(chǎn)生，同時誘導Cu-ZnSOD、GST、CAT、HSP70以及HSP90基因表達上調。而(+)-丙溴磷對相關基因表達的影響明顯弱于(-)-丙溴磷及rac-丙溴磷。維生素E(6×104molL-1)預處理可以劑量依賴性地降低細胞活性抑制率，使彗尾長度，ROS和MDA水平恢復至正常水平，進一步證實了氧化應激對細胞毒性的介導。除此之外，我們的研究結果顯示氧

7、化應激的產(chǎn)生先于細胞毒性和DNA損傷的產(chǎn)生，表明氧化應激是丙溴磷產(chǎn)生細胞毒性和基因毒性的起因而不是結果。
　　 (4)比較了甲胺磷、乙酰甲胺磷、氯胺磷、馬拉硫磷及馬拉氧磷5種有機磷農(nóng)藥誘導PC12細胞的細胞毒性、DNA損傷以及氧化應激的能力。MTT的結果顯示，這5種有機磷在最高濃度80mgL-1時，對PC12細胞活性均有顯著抑制，抑制率從大到小排序為馬拉氧磷(32.1％)＞甲胺磷(23.3％)＞馬拉硫磷(22.1％)＞氯胺磷(4

8、.0％)＞乙酰甲胺磷(3.2％)。彗星實驗的結果顯示，當濃度為40mgL-1時，暴露于有機磷中的細胞的彗尾長度和空白對照的比值從高到低依次為:馬拉氧磷(3.02倍)＞甲胺磷(2.35倍)＞馬拉硫磷（1.71倍）＞乙酰甲胺磷(1.44倍)＞氯胺磷（1.07倍）。在對氧化應激相關檢測終點的檢測中發(fā)現(xiàn)，甲胺磷、乙酰甲胺磷、馬拉硫磷和馬拉氧磷可以不同程度地誘導ROS和MDA的增加，并抑制SOD、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽(GSH)活性。維生