典型擬除蟲菊酯類農(nóng)藥潛在毒性的整合評價研究.pdf

1、隨著對環(huán)境污染物造成的人類健康和環(huán)境安全問題的重視，研究者開始將注意力轉(zhuǎn)向正在使用的農(nóng)藥對人類和動物引起的潛在毒性作用。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，擬除蟲菊酯類農(nóng)藥具有廣譜高效的生物活性、低的環(huán)境和食品殘留度、相對較低的哺乳動物毒性。生產(chǎn)生活中的廣泛使用使人類和生物不可避免地通過各種途徑長期暴露于擬除蟲菊酯中。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)擬除蟲菊酯能干擾生物體正常的功能，對人類和動物的健康造成相當(dāng)大的威脅。作為一類重要的手性農(nóng)藥，擬除蟲菊酯對非靶標(biāo)生物的各種潛

2、在毒性作用還存在對映體選擇性。
　　 目前關(guān)于擬除蟲菊酯各種潛在毒性的研究大多集中于外消旋體對生物個體或單個系統(tǒng)的影響，對單一對映異構(gòu)體引起的毒性作用及其分子機(jī)制的研究仍然非常少見。因此，我們選取以聯(lián)苯菊酯(BF)為代表的幾種常用擬除蟲菊酯，在不同的體內(nèi)和體外模型中研究手性擬除蟲菊酯類農(nóng)藥引起的免疫毒性、生殖內(nèi)分泌干擾和肝臟損傷。利用分子生物學(xué)手段，在細(xì)胞和分子水平上探討毒性發(fā)生的機(jī)制及對映體差異，以期對手性擬除蟲菊酯的潛在毒性

3、作用進(jìn)行比較全面的評價。主要研究內(nèi)容包括以下四個部分：
　　 (1)對農(nóng)藥等外源性化合物引起的健康風(fēng)險，尤其是免疫毒性等靶器官毒性的研究主要集中于母體化合物，鮮少涉及其代謝產(chǎn)物。我們選用人單核細(xì)胞U937作為體外模型，通過MTT、流式細(xì)胞儀和酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)，評價氯菊酯、右旋苯醚菊酯、氯氰菊酯、功夫菊酯和右旋苯氰菊酯及3種共同代謝產(chǎn)物3-phenoxybenzoic alcohol(PBCOH)、3-phenoxybenzaldeh

4、yde(PBCHO)和3-phenoxybenzoic acid(PBCOOH)的免疫細(xì)胞毒性。細(xì)胞活性和細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，5種擬除蟲菊酯及其代謝產(chǎn)物都能對單核細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性。代謝產(chǎn)物中的PBCHO和PBCOOH比其他測試化合物的細(xì)胞毒性更大，在10-5mol/L時分別能將細(xì)胞活性抑制至陰性對照的56.8％和50.6％，在10-6mol/L時則分別能誘導(dǎo)8.52％和8.81％的細(xì)胞凋亡。擬除蟲菊酯及其代謝產(chǎn)物對腫瘤壞死因子α(T

5、NFα)和白介素(ILs)的分泌水平都具有干擾作用，其中代謝產(chǎn)物比母體化合物的作用更強(qiáng)。PBCHO能引起IL-12p70的分泌水平上升為陰性對照組的1.87倍，而PBCOH和PBCOOH則能誘導(dǎo)5.88和7.96倍的TNFα分泌水平。研究結(jié)果表明，在體外模型中，擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的共同代謝產(chǎn)物能引起比起母體化合物更強(qiáng)的免疫細(xì)胞毒性。
　　 (2)在初步評估擬除蟲菊酯對單核細(xì)胞免疫毒性的基礎(chǔ)上，選擇聯(lián)苯菊酯作為擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的代表

6、，以人單核細(xì)胞U937和BALB/c小鼠分別作為體外和體內(nèi)生物模型，通過多種體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)方法，研究擬除蟲菊酯引起的免疫毒性及其對映體選擇性，并利用分子生物學(xué)手段深入研究聯(lián)苯菊酯對映體誘導(dǎo)免疫毒性的分子機(jī)制。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，聯(lián)苯菊酯并未引起任何免疫功能的紊亂，但能對脾臟細(xì)胞產(chǎn)生明顯的氧化損傷和細(xì)胞毒性。在單核細(xì)胞體外模型中，聯(lián)苯菊酯同樣顯示了免疫毒性作用，兩個對映異構(gòu)體在氧化損傷和細(xì)胞毒性的誘導(dǎo)上都顯示出明顯的對映體差異。通過引起不同程度

7、的氧化損傷、干擾細(xì)胞內(nèi)多條凋亡信號通路、產(chǎn)生選擇性的細(xì)胞毒性，聯(lián)苯菊酯對映異構(gòu)體能引起立體選擇性的免疫毒性。研究結(jié)果表明，聯(lián)苯菊酯能對非靶標(biāo)生物產(chǎn)生對映體選擇性的免疫毒性。
　　 (3)擬除蟲菊酯作為內(nèi)分泌干擾物，可能會干擾生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)的激素信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，從而對哺乳動物和人類產(chǎn)生潛在的生殖危害。我們以人絨毛膜上皮癌細(xì)胞系JEG-3作為模擬胎盤作用的體外模型，研究聯(lián)苯菊酯對細(xì)胞活性、激素分泌和相關(guān)基因表達(dá)的影響，探討聯(lián)苯菊酯外消

8、旋體與其對映體對滋養(yǎng)層細(xì)胞激素功能的干擾作用及其分子機(jī)制，并通過分子模擬的方法預(yù)測不同對映異構(gòu)體與雌激素受體僅(ERα)的相互作用模式.在利用細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)確定暴露濃度的基礎(chǔ)上，激素分泌和基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，聯(lián)苯菊酯不僅能夠促進(jìn)孕酮和人絨毛膜促性腺激素的分泌、誘導(dǎo)促性腺激素釋放激素I(GnRHI)及其受體GnRHRI表達(dá)水平的上調(diào)，還能顯著改變類固醇生成基因的表達(dá)水平。聯(lián)苯菊酯外消旋體和對映體都能通過雌激素受體通路的作用，干擾滋養(yǎng)層細(xì)

9、胞中的激素信號通路，而且聯(lián)苯菊酯對生殖內(nèi)分泌相關(guān)激素的干擾作用顯示出一致的對映體選擇性順序：S-BF>rac-BF>R-BF。分子模擬的結(jié)果顯示，聯(lián)苯菊酯對映異構(gòu)體與ERα形成的復(fù)合物在柔韌性和構(gòu)象變化上不存在明顯的差異，但s-BF在與ERα的結(jié)合中表現(xiàn)出比R-BF更強(qiáng)的親和力，這可能部分解釋了聯(lián)苯菊酯的對映體選擇性生殖內(nèi)分泌干擾作用。
　　 (4)低濃度擬除蟲菊酯引起的潛在肝臟毒性及其分子機(jī)制仍不清楚，目前常用的肝臟疾病臨床指

10、標(biāo)可能無法準(zhǔn)確指示潛在肝臟損傷的發(fā)生。我們以BALB/c小鼠作為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，通過對組織形態(tài)、酶活性、細(xì)胞活性、氧化損傷、caspase活性、細(xì)胞凋亡以及代謝相關(guān)基因表達(dá)水平的檢測，全面評價聯(lián)苯菊酯引起的潛在肝臟損傷，并深入研究毒性作用產(chǎn)生的分子機(jī)制。組織形態(tài)和血清酶活性都未發(fā)生明顯變化。但聯(lián)苯菊酯暴露對肝臟細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性和氧化應(yīng)激，同時引起caspase激活和線粒體細(xì)胞凋亡通路的啟動?；蛐酒慕Y(jié)果顯示，聯(lián)苯菊酯能廣泛地干擾代謝過程

11、，強(qiáng)烈誘導(dǎo)CYPs、GPXs、GSTs和激酶等氧化應(yīng)激相關(guān)基因。研究表明，即使在傳統(tǒng)臨床和病理指標(biāo)沒有出現(xiàn)明顯肝臟損傷的情況下，聯(lián)苯菊酯能夠引起氧化損傷，通過caspase介導(dǎo)、線粒體相關(guān)的細(xì)胞凋亡，最終引起肝臟損傷。
　　 正在使用的手性農(nóng)藥的健康與生態(tài)安全已成為全球關(guān)注的新問題。我們的研究結(jié)果說明，擬除蟲菊酯類農(nóng)藥可能通過引起對細(xì)胞的氧化損傷，干擾細(xì)胞內(nèi)外各種信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，經(jīng)由不同途徑啟動細(xì)胞凋亡，在分子與細(xì)胞水平上對不同的