6種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的抗雄激素作用及其機制.pdf

1、[目的]環(huán)境抗雄激素(EA)屬于環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，是指原本存在于環(huán)境中、能通過多種分子機制產(chǎn)生拮抗雄激素反應作用從而抑制雄性分化和性發(fā)育過程的一類化學物，大多數(shù)為雄激素受體(AR)拮抗劑。EA包括一些農(nóng)藥及其代謝產(chǎn)物、非甾體藥物、增塑劑等，其中農(nóng)藥及其代謝產(chǎn)物所占比例最大，同時也是該領域的研究熱點。擬除蟲菊酯類農(nóng)藥由于其廣譜、高效、低殘留、對人毒性較小等優(yōu)點在我國主要作為殺蟲劑得到廣泛應用，暴露人群比較大，此類農(nóng)藥近年來逐漸成為抗雄激素

2、農(nóng)藥篩檢的重點，為了保障生殖健康，有必要對擬除蟲菊酯類可能的抗雄激素作用進行研究。屬于此類的氯菊酯先前就被報道在體內(nèi)Hershberger試驗中顯示有抗雄激素活性，本研究選取了氯菊酯、以及立體化學結構與其相似的氟氯氰菊酯、高效氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、高效氯氰菊酯、聯(lián)苯菊酯共6種農(nóng)藥，通過體內(nèi)Hershberger試驗與體外穩(wěn)定轉染報告基因試驗相結合的方法探討這6種擬除蟲菊酯的抗雄激素作用及其可能機制，為全面評價此類農(nóng)藥的安全性提供一定的科

3、學依據(jù)。 [方法]體外雄激素依賴基因轉錄活化試驗采用穩(wěn)定轉染熒光素酶報告基因的人乳腺癌細胞株MDA-kb2細胞，該細胞株為美國國家環(huán)保局的Wilson教授所構建，細胞本身就表達內(nèi)源性的AR。細胞在37℃、0％CO2環(huán)境條件下生長，所用培養(yǎng)基為含10％胎牛血清(活性炭處理去除甾體激素)的Leibovitz'sL-15。先行MTT細胞毒性試驗，再根據(jù)此試驗結果設計雄激素依賴基因轉錄活化試驗的測試劑量，試驗時把細胞直接接種于96孔板，

4、等細胞貼壁后加入各種濃度受試物或已知抗雄激素處理細胞，同時加一定濃度的雙氫睪酮(DHT)來誘導熒光素酶基因的表達，誘導表達24h后裂解細胞，然后將熒光素酶測試液加入到細胞裂解液中，最后用1420多標記計數(shù)儀測定熒光素酶活性值。試驗中將羥基氟他胺作為拮抗劑陽性對照，同時用受試農(nóng)藥的溶媒作為溶劑對照，統(tǒng)計數(shù)值時以相對于溶劑對照組的熒光素酶活性值的倍數(shù)比值作為標化熒光強度單位，來間接表示抗雄激素作用的大小。AR拮抗劑通過作用于AR抑制熒光素酶

5、報告基因的轉錄表達。在預試驗基礎上，正式試驗至少重復2次，每次做4個平行樣品孔。體內(nèi)7天染毒Hershberger試驗中，對適應環(huán)境滿1周、4周齡大小的雄性SD大鼠行常規(guī)去勢手術(即雙側睪丸切除術)，術后恢復2周。將經(jīng)去勢6周齡雄性大鼠隨機化分為受試農(nóng)藥低、中、高劑量組，溶劑對照組、睪酮缺乏組、陽性對照組，每組共5只。除睪酮缺乏組外每只大鼠每天皮下注射丙酸睪酮(TP)100μg(溶于0.2ml花生油)，連續(xù)7天。陽性對照組、溶劑對照和睪

6、酮缺乏組分別同時灌胃給予氟他胺50mg/(kg·d)、同體積花生油；染毒組分別灌胃給予聯(lián)苯菊酯1.5、4.5和13.5mg/(kg·d)，氯氰菊酯7、21、63mg/(kg·d)，高效氯氰菊酯6、18、54mg/(kg·d)，氟氯氰菊酯6、18、54mg/(kg·d)，高效氟氯氰菊酯4、12、36mg/(kg·d)，氯菊酯15、45、135mg/(kg·d)，灌胃體積均為5ml/kg。每天根據(jù)當日所稱體重調(diào)整灌胃體積。最后一次染毒24h