擬除蟲菊酯類農(nóng)藥降解基因estA的表達(dá)、純化及活性分析.pdf

1、近年來(lái)，隨著擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的廣泛使用，由菊酯類農(nóng)藥殘留產(chǎn)生的環(huán)境、食品污染和農(nóng)產(chǎn)品國(guó)際貿(mào)易問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重，菊酯類農(nóng)藥的生物降解逐漸成為研究的熱點(diǎn)。本論文以課題組已克隆的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥降解基因estA(genbank：DQ906143)為出發(fā)基因，進(jìn)行了基因產(chǎn)物二級(jí)、高級(jí)結(jié)構(gòu)的生物信息學(xué)分析；全長(zhǎng)基因序列和具反應(yīng)活性結(jié)構(gòu)域基因序列的原核表達(dá)；表達(dá)產(chǎn)物的電泳檢測(cè)、復(fù)性及復(fù)性條件；表達(dá)產(chǎn)物的反應(yīng)條件、環(huán)境穩(wěn)定性及對(duì)農(nóng)藥的降解等方面的研究，

2、為進(jìn)一步利用降解酶基因資源研制擬除蟲菊酯類農(nóng)藥降解酶制劑，解決農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留提供技術(shù)平臺(tái)。
　　 EstA的生物信息學(xué)研究表明：EstA的分子量和等電點(diǎn)的理論值分別約為64.6KDa和4.40；EstA的二級(jí)結(jié)構(gòu)為23.50％的α螺旋、25.12％的β折疊、7.13％的β轉(zhuǎn)角和44.25％的無(wú)規(guī)卷曲。α螺旋存在明顯的結(jié)構(gòu)域差異性，其中80.6％的α螺旋存在于在第一個(gè)結(jié)構(gòu)域(1-370aa)中；EstA無(wú)二硫鍵和信號(hào)肽；EstA具

3、有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，第一個(gè)結(jié)構(gòu)域包含前370個(gè)氨基酸，與酶催化活性相關(guān)，第二結(jié)構(gòu)域包括剩余247個(gè)氨基酸(371-617)；EstA的催化位點(diǎn)為Ser207，Asp255和His313；EstA中存在鈣結(jié)合位點(diǎn)，分別為L(zhǎng)ys278、Asp283、Asp337、Ala281。
　　 EstA全長(zhǎng)編碼基因和催化活性結(jié)構(gòu)域編碼基因的原核表達(dá)研究表明：全長(zhǎng)編碼基因的表達(dá)產(chǎn)物具酯酶活性，而單一催化活性結(jié)構(gòu)域編碼基因的表達(dá)產(chǎn)物無(wú)酯酶活性，證明Es

4、tA的第二個(gè)結(jié)構(gòu)域雖然不具有催化位點(diǎn)，但可能與酶活性構(gòu)象的形成密切相關(guān)；原核表達(dá)的EstA主要以包涵體形式存在，包涵體可經(jīng)6 mol/L的尿素有效溶解；EstA分解α醋酸萘酚實(shí)驗(yàn)證明該酶具有羧酸酯酶活性，以羧酸酯酶活性為檢測(cè)指標(biāo)的實(shí)驗(yàn)表明：EstA表達(dá)產(chǎn)物的最佳復(fù)性條件為：pH7.5、Ca2+濃度2mmol/L、蛋白濃度20μg/mL。
　　 對(duì)EstA活性表達(dá)產(chǎn)物的理化性質(zhì)研究表明：該酶的最適反應(yīng)條件(α醋酸萘酚為底物)為：p

5、H7.0、Ca2+濃度0.1mmol/L、溫度35℃。氣相色譜檢測(cè)活性EstA對(duì)部分農(nóng)藥的降解結(jié)果表明：該蛋白對(duì)擬除蟲菊酯類農(nóng)藥高效氯氰菊酯、氯菊酯、氯烯炔菊酯、功夫菊酯及有機(jī)磷類農(nóng)藥毒死蜱有降解能力，30℃條件下溫育八小時(shí)對(duì)上述農(nóng)藥的降解率分別為：高效氯氰菊酯：79.07％、功夫菊酯：24.29％、氯烯炔菊酯：19.73％、氯菊酯：44.74％、毒死蜱：27.42％。
　　 極端環(huán)境實(shí)驗(yàn)表明：EstA表達(dá)產(chǎn)物具高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿