銅綠假單胞菌GF31的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥降解酶的分離純化和特性研究.pdf

1、擬除蟲菊酯類農(nóng)藥是目前世界上使用最廣泛的殺蟲劑之一，在環(huán)境中的殘留和積累，給人類健康和生態(tài)系統(tǒng)造成了巨大的威脅。生物降解因?yàn)槠涓咝А踩?、無二次污染，已成為農(nóng)藥殘留修復(fù)的有效措施。
　　本文首先對(duì)一株本實(shí)驗(yàn)室前期篩選到的擬除蟲菊酯高效降解菌株GF31進(jìn)行了16S rDNA分子進(jìn)化分析，鑒定其為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，并提交中國(guó)普通微生物菌種保藏中心保藏(CGMCC7173)。對(duì)GF31的菊酯降

2、解酶的定域?qū)嶒?yàn)表明，酶活力主要位于胞外，占總酶活的81.5％，說明其為胞外酶，這與目前普遍報(bào)道的胞內(nèi)菊酯降解酶不同。對(duì)產(chǎn)酶培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，得到最優(yōu)培養(yǎng)基組成為:廢糖蜜5g/L，蛋白胨10g/L，NaH2PO40.12 g/L，苯丙氨酸1.0 g/L。培養(yǎng)到12 h時(shí)，再加入0.1％的吐溫80。菌株GF31的產(chǎn)酶量增加約2.6倍，為后續(xù)開展降解酶分離純化和結(jié)構(gòu)性質(zhì)等研究奠定了基礎(chǔ)。
　　根據(jù)GF3的菊酯降解酶的基本性質(zhì)設(shè)計(jì)出一套分

3、離純化方案，經(jīng)過超濾、鹽析、離子交換和凝膠層析四步純化，菊酯降解酶最終純化倍數(shù)為32.8倍，酶活回收率為26.6％，比酶活達(dá)到2571.9 U/mg。經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)，表明純化酶已達(dá)電泳純，分子量約為53 KDa。
　　對(duì)降解酶進(jìn)行鑒定和結(jié)構(gòu)表征，測(cè)得其質(zhì)譜分子量為51 KDa，結(jié)合SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果，說明該酶是一個(gè)單亞基蛋白。測(cè)得其N-端氨基酸的順序?yàn)?NH2-Thr-Pro-Gly-Lys-Pro-As

4、n-Pro-Ser-Ile-Cys。經(jīng)還原和非還原的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，結(jié)果表明降解酶分子內(nèi)可能含有二硫鍵;糖基化測(cè)定結(jié)果表明降解酶不含或僅含極少量的糖。對(duì)純化酶的肽指紋圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果表明其與來源于Pseudomonas aeruginosa M18和PAO1的假定的氨肽酶具有很高的相似性，認(rèn)為可能為同一種蛋白。
　　根據(jù)Pseudomonas aeruginosa PAO1的aminopeptidase基因序列設(shè)計(jì)

5、引物，通過PCR獲得了銅綠假單胞菌GF31的菊酯降解酶基因APs(在GeneBank中登記號(hào)為KT735188)，并成功實(shí)現(xiàn)APs在大腸桿菌宿主中的異源表達(dá)。對(duì)菊酯降解酶基因APs進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明該酶由536個(gè)氨基酸組成，前24個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，第25-36個(gè)氨基酸為前導(dǎo)肽，隨后是500個(gè)氨基酸殘基的成熟蛋白，分子量為53.7 KDa，與純化蛋白的分子量相符。蛋白保守域分析和氨基酸序列分析的結(jié)果表明，菊酯降解酶APs屬于鋅-

6、肽酶超家族(M28家族)的氨肽酶，具有氨肽酶典型的催化三元體(Glu341，Ser423和His296)以及與Zn配位的5個(gè)氨基酸殘基His296，Asp308，Glu341，Asp369，和His467。這是目前為止第一個(gè)報(bào)道的具有擬除蟲菊酯降解能力的氨肽酶。對(duì)菊酯降解酶APs的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，與純化酶的氨基酸組成結(jié)果基本一致，僅Glu、Gly和Pro的含量誤差較大;對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)，結(jié)果表明α螺旋含量為32.8％，β折疊含

7、量為20.6％，無規(guī)則卷曲的含量為46.6％;以PDB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中相同性最高的灰色鏈霉菌屬Streptomyces griseus氨肽酶為模板，利用同源建模法獲得APs三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖。
　　對(duì)菊酯降解酶進(jìn)行了比較系統(tǒng)的降解特性研究，為該酶的實(shí)際工程應(yīng)用提供理論依據(jù)。該酶的最適降解pH值為7.0，最適降解溫度為60℃;在70℃以內(nèi)，pH5.0～9.0范圍內(nèi)均可保持良好的活性，表明該酶具有優(yōu)良的穩(wěn)定性;Ag+、Hg+和Cu2+對(duì)該酶

8、有明顯的抑制作用，而其它金屬離子對(duì)其活性影響不大。離子螯合劑EDTA和phenanthroline對(duì)菊酯降解酶活力沒有抑制作用，說明菊酯降解酶活力不依賴于金屬離子。表面活性劑SDS和Triton X-100能夠明顯抑制菊酯降解酶活力。菊酯降解酶能催化降解氯氰菊酯、甲氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯等多種擬除蟲菊酯，其中對(duì)氯氰菊酯降解活力最高。反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定結(jié)果表明，以氯氰菊酯為底物時(shí)，Vmax=0.0017μM/s，Km=47.7μM，