水產(chǎn)養(yǎng)殖學(xué)畢業(yè)論文-不同干露時(shí)間對(duì)三疣梭子蟹非特異性免疫系統(tǒng)的影響

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文</b></p><p><b>　?。?0 屆）</b></p><p>　　不同干露時(shí)間對(duì)三疣梭子蟹非特異性免疫系統(tǒng)的影響</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級(jí)

2、 水產(chǎn)養(yǎng)殖學(xué) </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號(hào) </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目錄</b

3、></p><p>　　中文摘要…………………………………………………………………………3</p><p>　　英文摘要…………………………………………………………………………4</p><p>　　1 前言………………………………………………………………………… 6</p><p>　　2 材料和方法………………………………………

4、………………………… 6</p><p>　　2.1 材料………………………………………………………………………7</p><p>　　2.2 方法………………………………………………………………………7</p><p>　　2.2.1 干露實(shí)驗(yàn)及采樣………………………………………………………7</p><p>　　2.2.2 血淋巴

5、細(xì)胞觀察和計(jì)數(shù)………………………………………………7</p><p>　　2.2.3 血清中酶活力和蛋白測(cè)定……………………………………………8</p><p>　　2.2.4 干露實(shí)驗(yàn)中梭子蟹成活率……………………………………………8</p><p>　　2.2.5 數(shù)據(jù)處理………………………………………………………………8</p><p

6、>　　3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果…………………………………………………………………… 8</p><p>　　3.1 不同干露時(shí)間下三疣梭子蟹活力觀……………………………………8</p><p>　　3.2 不同干露時(shí)間對(duì)梭子蟹血淋巴的凝固時(shí)間的影響……………………9</p><p>　　3.3 干露不同時(shí)間對(duì)暫養(yǎng)梭子蟹免疫酶活力和血清蛋白影響……………9</

7、p><p>　　3.4 干露對(duì)梭子蟹血細(xì)胞總數(shù)及大顆粒細(xì)胞比例的影響…………………10</p><p>　　3.5 干露實(shí)驗(yàn)梭子蟹最終成活率……………………………………………11</p><p>　　4 討論………………………………………………………………………… 11 </p><p>　　5 結(jié)論…………………………………………………

8、……………………… 13 </p><p>　　6 致謝………………………………………………………………………… 13</p><p>　　參考文獻(xiàn)…………………………………………………………………………14 </p><p>　　不同干露時(shí)間對(duì)三疣梭子蟹非特異性免疫系統(tǒng)的影響</p><p>　　[摘要] 本實(shí)驗(yàn)研究了干露不同時(shí)間對(duì)三疣梭

9、子蟹非特異性免疫系統(tǒng)的影響，將三疣梭子蟹離水干露1h、2h后，記干露一小時(shí)組為A組，另一組為B組，進(jìn)行恢復(fù)性暫養(yǎng)，對(duì)三疣梭子蟹血細(xì)胞總數(shù)、血清蛋白、酸、堿性磷酸酶、超氧化物歧化酶等非特異性免疫系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行跟蹤檢測(cè)。結(jié)果表明：正常梭子蟹的血淋巴凝固時(shí)間平均血淋巴凝固時(shí)間為38s，干露梭子蟹血淋巴凝固時(shí)間隨干露時(shí)間的延長發(fā)生明顯變化；干露實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組血細(xì)胞總數(shù)極顯著降低（P<0.01），而大顆粒細(xì)胞比例相反則有顯著上升(P＞0.

10、05）； 2h干露組血細(xì)胞總數(shù)低于1h干露組，差異極顯著（P <0.01）；經(jīng)過干露恢復(fù)后：1h干露組血細(xì)胞總數(shù)雖然較恢復(fù)前數(shù)量有所上升，但是比對(duì)照組仍然偏低，差異顯著（P <0.05）；2h干露組血細(xì)胞總數(shù)恢復(fù)前無明顯變化，仍然比對(duì)照組數(shù)值偏低，差異均極顯著（P <0.01）。大顆粒細(xì)胞比例：干露組和對(duì)照組之間變化明顯，干露組低于對(duì)照組（P <0.01）；大顆粒細(xì)胞占血細(xì)胞總數(shù)的百分比差異顯著，1h、2h干露組

11、高于對(duì)照組（P <0.05）； 但是后續(xù)恢復(fù)暫養(yǎng)期大顆粒細(xì)胞比例也無明顯變化；梭子蟹血清蛋白含量與對(duì)照組相比</p><p>　　[關(guān)鍵詞] 三疣梭子蟹 干露 血細(xì)胞總數(shù) 血清蛋白 酸性磷酸酶 堿性磷酸酶 超氧化物歧化酶</p><p>　　Study on influences of air-exposure on the non-specific

12、immunological parameters of Portunus trituberculatus</p><p>　　[Abstract] This experimental study on influences of air-exposure on the non-specific immunological parameters of Portunus trituberculat

13、us,Make the Portunus trituberculatus air-exposure 1h, 2h, Mark group A and group B,portunus total hemocyte count、serum protein, acid, alkaline phosphatase, superoxide dismutase enzymes non-specific immune system-rel

14、ated indicators for tracking and detection. The results showed that: the hemolymph coagulation time of normal crab is an average of 38s, the hemolymph</p><p>　　[Key words] Portunus trituberculatus a

15、ir-exposure Total hemocyte count </p><p>　　Acid phosphatase Alkaline phosphatase Superoxide Dismutase</p><p>　　不同干露時(shí)間對(duì)三疣梭子蟹非特異性免疫系統(tǒng)的影響</p><p><b>　　1 前言</b><

16、;/p><p>　　三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）是我國重要的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)蟹類之一，山東半島至南海海域均有廣泛分布，是近年來重點(diǎn)海水捕撈品種和海水增養(yǎng)殖的品種[1]。近年來，隨著養(yǎng)殖方式的不斷變更進(jìn)步，養(yǎng)殖環(huán)節(jié)的不斷優(yōu)化使得該產(chǎn)業(yè)在東部沿海地區(qū)迅猛發(fā)展，現(xiàn)已成為浙江省六大優(yōu)勢(shì)養(yǎng)殖品種之一。三疣梭子蟹養(yǎng)殖方式繁多，其中圍塘輪養(yǎng)、淺海蟹籠吊養(yǎng)、海捕蟹暫養(yǎng)育肥、沙池精養(yǎng)、工廠化養(yǎng)殖等多種養(yǎng)殖模式

17、的在東部沿海地區(qū)大力推廣，尤其在浙江省，全省一年創(chuàng)收超過3億元。海捕梭子蟹育肥暫養(yǎng)是梭子蟹養(yǎng)殖生產(chǎn)的重要組成部分，主要是利用9－10月份梭子蟹海區(qū)自然資源數(shù)量與價(jià)格優(yōu)勢(shì)，收購海捕蟹，經(jīng)過一段時(shí)間的沙池暫養(yǎng)與土池育肥后上市，反季節(jié)上市，經(jīng)濟(jì)效益十分可觀。</p><p>　　雖然海捕暫養(yǎng)梭子蟹養(yǎng)殖管理相對(duì)簡(jiǎn)單，但是近年來該產(chǎn)業(yè)連續(xù)出現(xiàn)大面積縮減，主要原因是收購的海捕蟹成活率較低，造成極大的養(yǎng)殖風(fēng)險(xiǎn)。據(jù)調(diào)查，上世紀(jì)9

18、0年代海捕梭子蟹暫養(yǎng)成活率基本在80%以上，以后隨著漁獲量增加，成活率逐漸下降。近年來平均成活率只有10%～20%左右。根據(jù)筆者調(diào)查，用于暫養(yǎng)的海捕梭子蟹主要收購于我國近海的蟹籠捕撈蟹，梭子蟹捕撈出水后，由于是海上作業(yè)，處理較為粗放。從梭子蟹捕撈出水 — 分級(jí)挑揀 ─ 運(yùn)輸船中轉(zhuǎn) ─ 到達(dá)碼頭 ─ 分揀─運(yùn)輸至?xí)吼B(yǎng)池，經(jīng)歷多次干露、冷水浸洗、物理晃動(dòng)、溫差驟變等環(huán)境、物理因素的脅迫，不可避免會(huì)造成外傷以及內(nèi)部循環(huán)系統(tǒng)損傷[2]。筆者認(rèn)為

19、多次長時(shí)間的干露、物理晃動(dòng)等可能均會(huì)引起三疣梭子蟹體內(nèi)某些生理指標(biāo)的改變，進(jìn)而導(dǎo)致后期暫養(yǎng)成活率降低。</p><p>　　已有的研究表明，環(huán)境脅迫[3]，例如水質(zhì)突變、捕撈、干擾等會(huì)造成水生生物的應(yīng)激反應(yīng)，短時(shí)間的應(yīng)激反應(yīng)可能是一種保護(hù)性狀態(tài)，但是長時(shí)間的應(yīng)激反應(yīng)，會(huì)造成機(jī)體的防御功能降低，容易遭受疾病侵襲導(dǎo)致死亡[4]。本實(shí)驗(yàn)將三疣梭子蟹離水干露不同時(shí)間后，進(jìn)行后續(xù)暫養(yǎng)，對(duì)其進(jìn)行跟蹤檢測(cè)三疣梭子蟹血細(xì)胞總數(shù)、

20、血清蛋白、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、超氧化物歧化酶等非特異性免疫系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)[5]，以期對(duì)離水干露對(duì)三疣梭子蟹健康影響進(jìn)行評(píng)估，為海捕暫養(yǎng)蟹收購工藝及健康狀況評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。</p><p><b>　　2 材料與方法</b></p><p><b>　　2.1材料</b></p><p>　　試驗(yàn)地點(diǎn)：干露及后續(xù)暫養(yǎng)試

21、驗(yàn)在浙江省海洋水產(chǎn)研究所西軒試驗(yàn)場(chǎng)進(jìn)行，非特異性免疫指標(biāo)在浙江省海洋水產(chǎn)研究所病害中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。</p><p>　　試驗(yàn)動(dòng)物及暫養(yǎng)條件：本實(shí)驗(yàn)用的三疣梭子蟹均用蟹籠捕撈自浙江省海洋水產(chǎn)研究所西軒試驗(yàn)場(chǎng)的梭子蟹養(yǎng)殖塘，單個(gè)體重為（50.0+15.45g），健康狀態(tài)良好頭胸甲長均在4.5cm以上，均為雄性。三疣梭子蟹暫養(yǎng)于直徑約為3米，水深約為0.6m聚乙烯塑料養(yǎng)殖桶內(nèi)，每天投喂新鮮小黃魚、帶魚魚塊，每天換水50

22、%。水溫25-27℃，試驗(yàn)室內(nèi)溫度29.5～31℃，溶解氧5mg/L以上，pH 8.2左右，鹽度26，暫養(yǎng)一周后開始試驗(yàn)。</p><p>　　儀器及工具：解剖剪，注射器，剪剖盤，溫度計(jì)，濕度計(jì)，酒精棉球，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板， 7221型分光光度計(jì)，臺(tái)式超低溫冷凍離心機(jī)。</p><p>　　試劑：75%的酒精；10%的福爾馬林溶液；蛋白檢測(cè)試劑盒、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)和超

23、氧化物歧化酶(SOD)測(cè)試盒均購自南京建成生物工程研究所。 </p><p><b>　　2.2方法</b></p><p>　　2.2．1干露實(shí)驗(yàn)及采樣</p><p>　　預(yù)試驗(yàn)：預(yù)實(shí)驗(yàn)氣溫30℃，濕度89%，水溫28℃，分別將梭子蟹干露1h、2h、2.5h、3h，每個(gè)時(shí)間段組梭子蟹7只，每隔10min，以木棒觸碰及肉眼觀察各組梭子蟹活動(dòng)情

24、況，干露后將各組梭子蟹重新暫養(yǎng)于塑料桶（70cm×50cm×35cm），水深25cm，觀察24h。選擇適宜的干露時(shí)間。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在此試驗(yàn)氣溫與濕度下，干露3h將直接導(dǎo)致死亡，而干露2h組則死亡2只，干露1h組死亡1只，干露30min組未死亡。因此確定正式試驗(yàn)的干露時(shí)間為1h和2h。</p><p>　　表1干露不同時(shí)間對(duì)梭子蟹活力的影響</p><p>　　Tab

25、.1 The influences of air-exposure on the living activities of Portunus trituberculatus</p><p>　　正式試驗(yàn)分組：試驗(yàn)設(shè)3組：干露1h和2h兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別記為A、B、C組。每個(gè)大組實(shí)驗(yàn)梭子蟹50只。 </p><p>　　梭子蟹活力觀察：實(shí)驗(yàn)期間不間斷觀察并記錄梭子蟹的活力以及生存狀態(tài)。

26、 </p><p>　　采樣：干露時(shí)間到后，每個(gè)大組迅速隨機(jī)取10只梭子蟹進(jìn)行采樣，用75%的酒精棉球擦拭梭子蟹游泳足基膜處，用事先吸入0.5mL的10%福爾馬林固定液的一次性注射器準(zhǔn)確抽取0.5mL血液，迅速混勻，用于血細(xì)胞計(jì)數(shù)；另外用一次性注射器盡可能完全抽取梭子蟹血淋巴，置于5ml離心管，常溫放置2小時(shí)后，靜置于4℃冰箱過夜，然后以無菌

27、吸管將凝固血淋巴塊與離心管壁剝離，3000r/min冷凍離心，分離血清保存于-70℃超低溫冰箱，用于各項(xiàng)非特異性免疫指標(biāo)的測(cè)定。</p><p>　　血淋巴凝固時(shí)間測(cè)定：采樣的梭子蟹抽取約0.2mL血液，迅速滴加于潔凈載玻片上，開始計(jì)時(shí)，同時(shí)緩緩將載玻片進(jìn)行左右傾斜晃動(dòng)，以血淋巴不再流動(dòng)為凝固時(shí)間。 </p><p>　　干露后恢復(fù)試驗(yàn)：A、B、C各組取樣完畢后，各組剩余的20只梭子蟹暫養(yǎng)

28、于大養(yǎng)殖桶，進(jìn)行恢復(fù)試驗(yàn)。各組進(jìn)行正常換水和投餌，記錄期間死亡率，持續(xù)暫養(yǎng)3d、6d后再隨機(jī)選取存活梭子蟹的一半進(jìn)行上述采樣程序，采血并記錄血淋巴凝固時(shí)間。對(duì)照組不進(jìn)行干露，直接進(jìn)行采樣進(jìn)行與實(shí)驗(yàn)組相同的實(shí)驗(yàn)并記錄。</p><p>　　2.2.2血淋巴細(xì)胞觀察和計(jì)數(shù)</p><p>　　普通血球計(jì)數(shù)板（25×16）進(jìn)行血細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)及大顆粒細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)，為存檔及提高計(jì)數(shù)效率，用

29、顯微照相系統(tǒng)將記數(shù)框內(nèi)圖像拍下，然后在電腦上進(jìn)行計(jì)數(shù)，每個(gè)樣品計(jì)數(shù)3次。血細(xì)胞及大顆粒細(xì)胞總數(shù)= =N×25/5×10×106×2 (N為五個(gè)中方格的血細(xì)胞總數(shù))</p><p>　　2.2.3血清中酶活力和蛋白測(cè)定</p><p>　　采用南京建成生物工程研究所酶活力測(cè)試盒測(cè)定AKP、ACP、SOD的活力，其中，AKP以100mL血清在37℃與基質(zhì)

30、作用30分鐘產(chǎn)生1mg酚為1個(gè)活力單位；ACP以100ml血清在37℃與基質(zhì)作用30分鐘產(chǎn)生1mg酚為一個(gè)金氏單位；SOD以每毫升反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為一個(gè)SOD活力單位（U），用分光光度計(jì)測(cè)定各測(cè)量管的吸光度，具體計(jì)算方法參考試劑盒說明進(jìn)行?？捡R斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定，對(duì)干露蟹采集處理好的血清樣本用0.85%的生理鹽水100倍稀釋，測(cè)定595nm的吸光度，由于試劑盒方法靈敏度高，為了在一定范圍內(nèi)成線性關(guān)系，血清樣本預(yù)

31、先用生理鹽水稀釋至1.3mg/mL以下。</p><p>　　2.2.4干露實(shí)驗(yàn)中梭子蟹成活率</p><p>　　在環(huán)境溫度為34℃左右，相對(duì)濕度達(dá)到50%的相對(duì)穩(wěn)定的環(huán)境條件下，對(duì)海捕暫養(yǎng)三疣梭子蟹進(jìn)行干露處理，分別以干露1h和2h作為臨界設(shè)定兩個(gè)實(shí)驗(yàn)大組，記為C組和D組，此外再設(shè)立一個(gè)對(duì)照組，對(duì)梭子蟹進(jìn)行干露后持續(xù)死亡率實(shí)驗(yàn)，從而獲得梭子蟹最終成活率。每組30只梭子蟹，C組干露1h；

32、D組干露2h后入水，對(duì)照組不進(jìn)行干露，對(duì)干露后的梭子蟹進(jìn)行持續(xù)養(yǎng)殖6天，正常換水和投喂鮮活餌料，最終統(tǒng)計(jì)梭子蟹成活率。</p><p><b>　　2.2.5數(shù)據(jù)處理</b></p><p>　　實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采用10個(gè)樣品進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定，每個(gè)樣品進(jìn)行2次測(cè)試取平均值，對(duì)干露實(shí)驗(yàn)死亡率進(jìn)行累計(jì)統(tǒng)計(jì)，再通過在實(shí)驗(yàn)類型和實(shí)驗(yàn)組內(nèi)不同條件下對(duì)血細(xì)胞形態(tài)和密度，各種酶活力及蛋

33、白含量的測(cè)定，用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS11.5和EXCEL軟件處理數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)值均以平均值+標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）表示。各種酶活力及蛋白濃度的計(jì)算參照試劑盒說明進(jìn)行。</p><p><b>　　3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果</b></p><p>　　3.1 不同干露時(shí)間下三疣梭子蟹活力觀察</p><p>　　不同干露時(shí)間下三疣梭子蟹的活力觀察結(jié)果如下：

34、 </p><p>　　干露后活動(dòng)反應(yīng)：5min個(gè)別開始往體外吐白沫，觸碰時(shí)個(gè)別行動(dòng)遲緩；7min 所有蟹都大量吐白沫，大部分蟹觸碰后無反應(yīng)；15min 用手拿起后，足部有活動(dòng)跡象，大鰲無攻擊性，放下后還能緩慢移動(dòng)；30min 下顎活動(dòng)頻率加快，拿起后各個(gè)附肢下垂，放下尚能移動(dòng)；36min 下顎無運(yùn)動(dòng)跡象，白沫量亦不斷增多，拿起后放下有運(yùn)動(dòng)跡象；45min蟹甲殼顏色變深。1h10min 白沫數(shù)量持續(xù)增多，下顎偶見

35、活動(dòng)，觸碰無反應(yīng)；1h20min 拿起蟹后亦鰲和附肢無動(dòng)的跡象，附肢下垂，個(gè)別下顎在動(dòng)；背部顏色越深；1h43min 蟹拿起后放回?zé)o生命跡象，明顯變化是蟹背兩個(gè)疣狀突起顏色變深；之后均為明顯活動(dòng)，觸碰均無反應(yīng)。</p><p>　　干露恢復(fù)：干露1h后放入水中，1h07min第一組蟹活力全部恢復(fù)，下顎均活動(dòng)，觸碰后反應(yīng)敏捷，能迅速游動(dòng)，背部顏色變正常；1h30min該組蟹能攝食鮮活飼料；在持續(xù)的觀察過程中，無其它

36、變化。干露2h后放入水中，約30min后所有蟹活力恢復(fù)，觸碰后都能迅速游動(dòng)，較干露1h的蟹相比，敏捷程度明顯下降；并且無攝食現(xiàn)象；干露2h30min，約需30min可見偶爾有蟹活力恢復(fù)。干露3h，死亡率達(dá)到60%，活力恢復(fù)較差。</p><p>　　3.2不同干露時(shí)間對(duì)梭子蟹血淋巴的凝固時(shí)間的影響</p><p>　　記錄不同組內(nèi)每只梭子蟹血淋巴的凝固時(shí)間，已死亡的梭子蟹血淋巴凝固時(shí)間均超

37、過2min或不凝固的均不予統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示正常梭子蟹的血淋巴凝固時(shí)間在1min之內(nèi)，平均血淋巴凝固時(shí)間為38s，干露梭子蟹血淋巴凝固時(shí)間隨干露時(shí)間的延長發(fā)生明顯變化，表2顯示了梭子蟹血淋巴在干露不同時(shí)間的凝集性，從中看出，干露時(shí)間越長血淋巴凝固時(shí)間相對(duì)延長；對(duì)于干露后存活下來的蟹，正常養(yǎng)殖，血淋巴凝固時(shí)間又恢復(fù)到了正常水平。</p><p>　　表2不同取樣時(shí)間血淋巴的凝固時(shí)間</p><p&g

38、t;　　Tab2. Blood coagulation time of Portunus trituberculatus at different sampling time</p><p>　　3.3干露不同時(shí)間對(duì)暫養(yǎng)梭子蟹免疫酶活力和血清蛋白影響</p><p>　　梭子蟹干露實(shí)驗(yàn)蛋白含量和各種免疫相關(guān)酶活性的測(cè)定結(jié)果及不同時(shí)間處理的各項(xiàng)指標(biāo)的T檢驗(yàn)如表3和表4。從中看出，相對(duì)延長干露

39、時(shí)間，血淋巴內(nèi)蛋白含量有顯著變化，干露1h和干露2h與對(duì)照組相比，干露1h蛋白含量變化不大，而干露2h后蛋白含量差異顯著（P<0.05）；酸性磷酸酶活性隨干露時(shí)間延長略有增強(qiáng)，但總的來看與對(duì)照組和其它人為干擾差異不顯著（P＞0.05）；干露1h的堿性磷酸酶活力在及恢復(fù)3天后均與對(duì)照組差異明顯，但是干露2h后其堿性磷酸酶活性與對(duì)照組未表現(xiàn)出明顯差異；干露操作引起超氧化物歧化酶活力的變化比較明顯，無論是干露和對(duì)照比較、恢復(fù)組和對(duì)照比較

40、差異均極顯著(P＜0.01)，干露1h和干露2h相比，SOD活力和對(duì)照組以及活力恢復(fù)組之間的差異均不顯著（P＞0.05）。</p><p>　　表3 不同干露及恢復(fù)時(shí)間對(duì)三疣梭子蟹非特異性免疫指標(biāo)的影響</p><p>　　Tab3. The influences of air-exposure on the non-specific immune responses of Portunu

41、s trituberculatus</p><p>　　表4 血清蛋白和三種酶非特異性指標(biāo)T檢驗(yàn)結(jié)果</p><p>　　Tab 4.Result of T test</p><p>　　注：A代表干露1小時(shí)組；B代表干露2小時(shí)組；C代表對(duì)照組，D代表1小時(shí)干露恢復(fù)3天；E代表2小時(shí)干露恢復(fù)3天，以P＞0.05為差異不顯著；P＜0.05為差異顯著；P＜0.

42、01為差異極顯著。</p><p>　　3.4干露對(duì)梭子蟹血細(xì)胞總數(shù)及大顆粒細(xì)胞比例的影響</p><p>　　血細(xì)胞總數(shù)表明：干露實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組血細(xì)胞總數(shù)極顯著降低（P＜0.01），而大顆粒細(xì)胞比例相反則有顯著上升(P＞0.05）； 2h干露組血細(xì)胞總數(shù)低于1h干露組，差異極顯著（P＜0.01）；經(jīng)過干露恢復(fù)后：1h干露組血細(xì)胞總數(shù)雖然較恢復(fù)前數(shù)量有所上升，但是比對(duì)照組仍然偏低，差異顯著

43、（P＜0.05）；2h干露組血細(xì)胞總數(shù)恢復(fù)前無明顯變化，仍然比對(duì)照組數(shù)值偏低，差異均極顯著（P＜0.01）。大顆粒細(xì)胞比例：干露組和對(duì)照組之間變化明顯，干露組低于對(duì)照組（P＜0.01）；大顆粒細(xì)胞占血細(xì)胞總數(shù)的百分比差異顯著，1h、2h干露組高于對(duì)照組（P＜0.05）； 但是后續(xù)恢復(fù)暫養(yǎng)期大顆粒細(xì)胞比例也無明顯變化。具體結(jié)果見表5和表6。</p><p>　　表5 干露不同時(shí)間對(duì)三疣梭子蟹血細(xì)胞數(shù)量和大顆粒細(xì)胞比

44、例的影響</p><p>　　Tab 5. The influences of air-exposure on total hemocyte count，proportion of large granular cell of Portunus trituberculatus</p><p>　　表6 血淋巴細(xì)胞指標(biāo)T檢驗(yàn)結(jié)果</p><p>　　Tab

45、6.Result of T test</p><p>　　注：A代表干露1小時(shí)組；B代表干露2小時(shí)組；C代表對(duì)照組;D代表1小時(shí)干露恢復(fù)3天；E代表2小時(shí)干露恢復(fù)3天，以P＞0.05為差異不顯著；P＜0.05為差異顯著；P≤0.01為差異極顯著。</p><p>　　3.5干露實(shí)驗(yàn)梭子蟹最終成活率</p><p>　　干露（干露溫度30℃，濕度90%）結(jié)束后正常養(yǎng)殖

46、，結(jié)果顯示，三疣梭子蟹經(jīng)干露1小時(shí)和2小時(shí)后最終死亡率分別達(dá)到了30%，和70%。</p><p><b>　　4 討論</b></p><p>　　近年來的海捕梭子蟹暫養(yǎng)成活率較低，嚴(yán)重制約了該產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，其原因可能與海捕梭子蟹經(jīng)長期擠壓脅迫、干露、冷水刺激等物理刺激，導(dǎo)致出現(xiàn)較嚴(yán)重的應(yīng)激反應(yīng)，從而自身健康狀況與疾病抵抗力下降有關(guān)。養(yǎng)殖生物的死亡是養(yǎng)殖生物與暫養(yǎng)管理

47、、養(yǎng)殖環(huán)境、病原微生物綜合作用的結(jié)果，其中養(yǎng)殖生物自身健康狀況與疾病抵抗力是養(yǎng)殖成功與否的重要的因素之一，而評(píng)估養(yǎng)殖生物的健康狀況最直接的手段就是通過某些生理生化指標(biāo)以及其表觀活力特征。本研究對(duì)三疣梭子蟹干露不同時(shí)間后，其活力表現(xiàn)特點(diǎn)、血細(xì)胞總數(shù)、大顆粒細(xì)胞比例、血清蛋白[6]、酸堿性磷酸酶[7]、超氧化物歧化酶[8]等非特異性免疫指標(biāo)[9]進(jìn)行較為系統(tǒng)的研究，對(duì)干露脅迫對(duì)三疣梭子蟹健康狀況及非特異性免疫系統(tǒng)的影響進(jìn)行評(píng)估，為三疣梭子蟹

48、健康評(píng)估及收購工藝改良提供參考。</p><p>　　蟹類生物中中華絨螯蟹、鋸緣青蟹均能適應(yīng)長期的干露運(yùn)輸，在適宜溫濕度下，可在空氣中暴露1周而不死亡[10]，而三疣梭子蟹則不能長期干露運(yùn)輸，在適宜溫度下最長存活時(shí)間也比上述兩種蟹類較短。因此干露一定時(shí)間勢(shì)必會(huì)對(duì)三疣梭子蟹的健康狀況產(chǎn)生較大影響。限于試驗(yàn)條件，本試驗(yàn)干露的溫度較高，為了保證梭子蟹的存活，干露時(shí)間較短，但是試驗(yàn)結(jié)果仍然表現(xiàn)出較明顯的干露的時(shí)間效應(yīng)。從

49、干露不同時(shí)間對(duì)三疣梭子蟹的表觀活力影響來看，離水僅5min，梭子蟹已經(jīng)出現(xiàn)保護(hù)性的對(duì)外界反應(yīng)不靈敏狀態(tài)，口吐白色泡沫以保持呼吸的空氣濕潤，而干露至1h43min，梭子蟹已經(jīng)呈現(xiàn)假死狀態(tài)，對(duì)外界刺激無任何反應(yīng)，呼吸似乎也停止，但是放入水中后經(jīng)過約30min即可恢復(fù)運(yùn)動(dòng)，但是活力較低。證實(shí)在干露情況下，梭子蟹很快進(jìn)入保護(hù)性的新陳代謝降低的狀態(tài)，這有利于其生命力的延長。干露時(shí)間3小時(shí)，對(duì)梭子蟹的健康狀況影響較大，恢復(fù)活力的時(shí)間也較長。<

50、/p><p>　　血細(xì)胞總數(shù)雖然易受環(huán)境因素及蛻殼等生理因素影響，但是可以直接反應(yīng)甲殼動(dòng)物的健康狀況。甲殼類動(dòng)物在感染各種致病原或環(huán)境壓力下，THCs作為體細(xì)胞防御屏障會(huì)出現(xiàn)脫顆粒、吞噬、包裹等一系列免疫防御反應(yīng)，從而導(dǎo)致THCs下降[11] 。例如羅氏沼蝦在注射低濃度的氣單胞菌(Aeromonas veronii)后在4h到24h內(nèi)THCs就出現(xiàn)顯著性降低[12]，而日本囊對(duì)蝦在感染鐮刀菌后血細(xì)胞數(shù)僅有對(duì)照組的54

51、.3%[13]；受寄生蟲侵襲后血細(xì)胞也會(huì)顯著降低，蘭蟹（Callinectes sapidus）感染血卵渦鞭蟲（Hematodinium perezi）后THCs會(huì)下降50-70%[14]，而嚴(yán)重感染血卵渦鞭蟲（Hematodinium.sp）后，三疣梭子蟹血淋巴中甚至觀察不到血細(xì)胞的存在[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)，經(jīng)過僅1h、2h的干露后，即使放入水體中進(jìn)行暫養(yǎng)恢復(fù)3d，三疣梭子蟹的血細(xì)胞總數(shù)均比對(duì)照組要顯著降低，說明干露對(duì)梭子蟹的血

52、淋巴系統(tǒng)造成較為顯著的影響，而這種影響經(jīng)過短時(shí)間尚不能完全恢復(fù)。大顆粒細(xì)胞被認(rèn)為是甲殼類血細(xì)胞中較為重要的防御體系之一，受致病原刺激后，大顆粒細(xì)胞的比例會(huì)有明</p><p>　　血清蛋白含量也可以反映甲殼動(dòng)物的健康狀況，報(bào)導(dǎo)證實(shí)中國明對(duì)蝦感染W(wǎng)SSV后會(huì)造成血清蛋白含量增加[16]，但是中國明對(duì)蝦（Fenneropenaeus chinensis）和凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）感染病毒

53、后血清蛋白含量顯著降低的報(bào)導(dǎo)[17] [18],本試驗(yàn)中梭子蟹血清蛋白在干露1h后與對(duì)照組無顯著差異，但是干露2h后數(shù)值上升，與對(duì)照組差異顯著，但是在恢復(fù)3天后，蛋白含量恢復(fù)至對(duì)照組水平。</p><p>　　酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）屬于磷酸單酯水解酶類，由于兩種酶的催化反應(yīng)最適pH值不同而有所區(qū)分。其中ACP是吞噬溶酶體的重要組成部分之一，會(huì)伴隨著血細(xì)胞的防御性吞噬、包裹反應(yīng)而釋放，在生物體內(nèi)

54、參加磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移代謝,而AKP也是溶酶體的重要組成之一，但是還直接參與磷的代謝，對(duì)甲殼類鈣質(zhì)吸收、外骨骼形成等具有重要調(diào)節(jié)作用。本試驗(yàn)中，干露不同時(shí)間的三疣梭子蟹酸性磷酸酶雖然在數(shù)值上略有變動(dòng)但是與對(duì)照組相比無顯著差異，而堿性磷酸酶在干露1h后與對(duì)照組差異顯著，而干露2h后無顯著差異，這種數(shù)值上的變化的不規(guī)律性，尚有待進(jìn)一步研究。</p><p>　　生物在受到環(huán)境脅迫、病原微生物侵襲時(shí)均會(huì)產(chǎn)生大量活性氧，而超

55、氧化物歧化酶（SOD）是一類重要的清除活性氧的抗氧化酶，因此研究人員生物體內(nèi)SOD活性的與其免疫水平密切相關(guān)，可作為生物非特異性免疫系統(tǒng)指示性指標(biāo)[19][20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，干露組三疣梭子蟹血淋巴SOD活性具有極顯著降低，但是經(jīng)過3天恢復(fù)其數(shù)值又極顯著增加。提示可將SOD作為三疣梭子蟹健康狀況的指標(biāo)性參數(shù)。這說明梭子蟹在離水運(yùn)輸過程中其體內(nèi)SOD降低，但是經(jīng)過后期的恢復(fù)養(yǎng)殖，其SOD值又會(huì)上升，甚至超過正常水平。SOD活性經(jīng)過后期

56、長期養(yǎng)殖是否會(huì)恢復(fù)至對(duì)照組水平，有待下一步研究。</p><p>　　綜上，干露不同時(shí)間對(duì)三疣梭子蟹不同非特異性免疫指標(biāo)有或多或少的影響，其中以血細(xì)胞數(shù)量、血液凝固時(shí)間、超氧化物歧化酶活性波動(dòng)最大，說明可將這兩個(gè)指標(biāo)作為三疣梭子蟹受環(huán)境及物理性脅迫時(shí)的特征性指標(biāo)，可用于梭子蟹健康狀況評(píng)價(jià)的特征性指標(biāo)。</p><p><b>　　5結(jié)論</b></p>

57、<p>　　三疣梭子蟹血細(xì)胞總數(shù)、血液凝固時(shí)間、超氧化物歧化酶活性可作為其健康狀況評(píng)價(jià)指標(biāo)，亦推薦用于環(huán)境、物理脅迫、微生物感染、免疫增強(qiáng)劑篩選的特征性指標(biāo)。</p><p><b>　　[參 考 文 獻(xiàn)]</b></p><p>　　[1]王紅勇，王海波，賴秋明，等.遠(yuǎn)海梭子蟹人工育苗試驗(yàn) [J].海洋水產(chǎn)研究，2004，25（3）：78-80.

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