運(yùn)動(dòng)對(duì)高脂飲食性肥胖大鼠棕色脂肪組織線粒體形態(tài)和動(dòng)力學(xué)的影響及可能機(jī)制的研究

1、<p>　　運(yùn)動(dòng)對(duì)高脂飲食性肥胖大鼠棕色脂肪組織線粒體形態(tài)和動(dòng)力學(xué)的影響及可能機(jī)制的研究</p><p>　　摘 要：目的：探討有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)高脂飲食性肥胖大鼠脂肪線粒體形態(tài)和動(dòng)力學(xué)的影響，并對(duì)其可能的機(jī)制進(jìn)行探討。方法：將三周齡SD健康雄性大鼠隨機(jī)分為正常組和高脂飲食組，后者在第8周時(shí)選取體重超出正常對(duì)照組平均體重20%的大鼠為肥胖大鼠，再分為肥胖對(duì)照組、運(yùn)動(dòng)干預(yù)組，第16周時(shí)處死。采用透射電鏡觀察脂肪細(xì)

2、胞的線粒體形態(tài)，采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)脂肪細(xì)胞中NYGGF4基因的表達(dá)水平，采用Western blot 方法檢測(cè)Mfn1蛋白、 Mfn2蛋白、 Drp1蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果：1）肥胖組大鼠脂肪細(xì)胞線粒體體積變小、數(shù)量明顯減少，線粒體嵴斷裂、減少、消失，部分線粒體腫脹，甚至呈空泡狀；有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，肥胖組大鼠脂肪線粒體形態(tài)基本正常，與正常組接近，表現(xiàn)為線粒體嵴清晰可見，線粒體無明顯腫脹、皺縮。2）肥胖組大鼠脂肪細(xì)胞NYGGF4mRN

3、A、Mfn1蛋白表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組；Mfn2、Drp1蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，肥胖組大鼠脂肪細(xì)胞NYGGF4mRNA、Mfn1蛋白表達(dá)水平均顯著降低，與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：NYGGF4基因可能通過上調(diào)Mfn1</p><p>　　關(guān)鍵詞：運(yùn)動(dòng)；肥胖；線粒體；形態(tài)；動(dòng)力學(xué)；機(jī)制 </p><p>　　中圖分類號(hào)：G804.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

4、：A 文章編號(hào)：1006-2076（2013）01-0070-04 </p><p>　　近年來，隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們的生活水平不斷的提高，飲食結(jié)構(gòu)生活習(xí)慣發(fā)生了很大的改變，肥胖癥呈現(xiàn)增多的趨勢(shì)，肥胖及其發(fā)病機(jī)制的研究也受到廣泛關(guān)注[1-2]。棕色脂肪與能量平衡有關(guān)，棕色脂肪具有產(chǎn)熱功能，對(duì)維持能量平衡具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，肥胖大鼠棕色脂肪組織明顯減少，且棕色脂肪組織細(xì)胞存在線粒體損傷、能量代謝異常[3]。研究

5、表明，有氧運(yùn)動(dòng)能夠有效地控制脂肪的合成，增加脂肪的供能，促進(jìn)脂肪的消耗[4]。本研究通過觀察有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)前后肥胖大鼠棕色脂肪組織線粒體形態(tài)變化，探討導(dǎo)致肥胖大鼠棕色脂肪組織線粒體形態(tài)以及動(dòng)力學(xué)變化的可能機(jī)制。 </p><p><b>　　1 材料與方法 </b></p><p>　　1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 將34只3周齡SD健康雄性大鼠隨機(jī)分為2組：正常組8只，斷乳

6、后給予普通飼料喂養(yǎng)，在第8周時(shí)選取體重超出正常對(duì)照組平均體重為20%的大鼠16只，再隨機(jī)分為肥胖對(duì)照組、運(yùn)動(dòng)干預(yù)組，其中肥胖對(duì)照組繼續(xù)給予高脂飼料喂養(yǎng)，運(yùn)動(dòng)干預(yù)組給以普通飼料喂養(yǎng)的同時(shí)，每天采用無負(fù)重游泳運(yùn)動(dòng)1 h，每周5天。所有大鼠均在實(shí)驗(yàn)第16周時(shí)處死。 </p><p>　　普通飼料構(gòu)成為常規(guī)配方。高脂肪飼料配方如下：每100克普通飼料中加入全脂奶粉15 g，豬油5 g，黃肚豆15 g，雞蛋黃50 g，魚肝

7、油10滴，牛膽酸納0.5 g[3]。大鼠自由飲食攝食，自然晝夜采光。 </p><p>　　1.2 樣本的采集 隔夜禁食后將大鼠稱重（BW），麻醉，斷頭處死，迅速取肩胛間區(qū)棕色脂肪組織（BAT），睪周白色脂肪組織（WAT），稱重后，用銳利眼科剪將棕色脂肪組織標(biāo)本剪成2 mm×2 mm×2 mm左右的脂肪組織方塊，依次用40℃的2.5%的戊二醛專用電鏡固定液固定，0.1 mol/LPBS緩沖液洗

8、滌2次，1%鋨酸后固定30～60 min，常規(guī)電鏡樣品制備程序脫水、滲透、包埋、超薄切片、鈾鉛染色，電鏡觀察線粒體形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)；留取部分脂肪組織于-80℃冰箱保存，進(jìn)行NYGGF4 mRNA和M fn1、 M fn2及Drp1蛋白表達(dá)的測(cè)定。 </p><p>　　1.3 NYGGF4mRNA的表達(dá) 采用Trizol一步法提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)凝膠電泳顯示28 S、18S清晰條帶2條，測(cè)定 OD260/OD280

9、比值> 1.8。經(jīng)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后采用熒光定量RT-PCR法檢測(cè)棕色脂肪細(xì)胞中NYGGF4mRNA表達(dá)水平。從NCBI的nucleotide中查得目的基因和內(nèi)參照基因，聯(lián)系上海博亞生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)上下游引物。引物序列如下：NGGF4上游序列：5’CCTGTCAGACCCCACTTTC 3’，NGGF4下游序列：5’CAGCCCACTGTTTTCCAAAT3；β-actin上游序列：5’TCACCCACACTGTGGCCATGT A

10、GGA 3’，β-actin下游序列：5’CAGGGGAACCGGTCATTGCCAATGG3’。退火溫度均為55.4攝氏度。采用CT法計(jì)算NYGGF4mRNA相對(duì)表達(dá)量。目的基因 mRNA相對(duì)表達(dá)量 = 2CT（參考基因） - CT （目的基因）。 </p><p>　　1.4 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 應(yīng)用 Western blot技術(shù)測(cè)M fn1、M fn2及 Drp1蛋白的表達(dá)。各取100 m

11、g棕色脂肪組織剪碎并于玻璃勻漿器充分勻漿，加3～5倍體積的組織裂解液于冰盒中吹打30 min，4℃下12 000rpm離心10 min，取上清液。BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。取30微克總蛋白加上樣緩沖液煮沸 5 min后行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。將轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素膜放入50 g/L脫脂奶粉中，室溫下封閉1 h ，將稀釋好的一抗加入大小合適的塑料袋中，加入膜、去除氣泡40℃封好袋口，室溫反應(yīng)4 h后40℃過夜，

12、HRP標(biāo)記的二抗室溫作用1 h，化學(xué)發(fā)光后顯影、定影。掃描顯影條帶，記錄其灰度值。以β-actin為內(nèi)源性參照，計(jì)算Mfn1蛋白、Mfn2蛋白、Drp1蛋白相對(duì)表達(dá)量，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。取對(duì)照組均數(shù)為1，將數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。 </p><p>　　1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 10.0軟件分析，全部數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示，各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）

13、，選擇Homogeneity-of-variance顯示方差齊性，選擇Turkey比較各組間差異，P<0.05表示組間差異具有顯著性。 </p><p>　　2 結(jié)果 　　2.1 體重、棕色脂肪組織（BAT）、白色脂肪組織（WAT）的比較 與正常對(duì)照組比較，肥胖組大鼠體重顯著高于對(duì)照組，BAT顯著低于對(duì)照組，WAT與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與肥胖組相比，有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)組大鼠體重、WAT顯著下降，BAT與

14、肥胖組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。 </p><p>　　人體內(nèi)存在棕色和白色兩種脂肪，白色脂肪堆積在皮下，負(fù)責(zé)儲(chǔ)存多余熱量；棕色脂肪負(fù)責(zé)分解引發(fā)肥胖的白色脂肪，將后者轉(zhuǎn)化成二氧化碳、水和熱量，它可以加快人體新陳代謝，促進(jìn)白色脂肪消耗[5]。 </p><p>　　NYGGF4基因是最近發(fā)現(xiàn)的在肥胖兒童脂肪組織中高表達(dá)的基因，其在脂肪細(xì)胞中過表達(dá)，顯著降低了胰島素刺激的葡萄糖攝取，表明 NY

15、GGF4基因可以降低脂肪細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性，導(dǎo)致脂肪細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗（IR）[6]。目前，關(guān)于IR的發(fā)生機(jī)制存在許多學(xué)說，線粒體功能障礙學(xué)說是近年來提出的新理論[7]，主要是指線粒體損傷和線粒體密度下降引發(fā)脂肪酸代謝障礙或功能低下，導(dǎo)致線粒體氧化磷酸化功能受損、線粒體膜電位降低，不僅產(chǎn)能物質(zhì) （ATP）減少，而且活性氧 （ROS）產(chǎn)生增多，從而影響胰島素受體后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，最終導(dǎo)致胰島素抵抗。已知線粒體形態(tài)與其功能、代謝活動(dòng)密切相關(guān)

16、[8]。大量研究表明，有氧運(yùn)動(dòng)能調(diào)節(jié)代謝功能，增加熱能消耗，促進(jìn)脂肪分解[9]。 </p><p>　　本研究對(duì)肥胖大鼠棕色脂肪組織中線粒體的形態(tài)和數(shù)量進(jìn)行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肥胖大鼠脂肪細(xì)胞的線粒體體積變小，數(shù)量明顯減少，線粒體嵴斷裂、減少、消失，部分線粒體腫脹，甚至呈空泡狀等形態(tài)學(xué)異常，提示肥胖大鼠線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能存在損傷；有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，肥胖組大鼠肥線粒體形態(tài)接近于正常對(duì)照組，表現(xiàn)為線粒體形態(tài)基本正常，無明

17、顯腫脹、皺縮，膜結(jié)構(gòu)完整，清晰可見；并且白色脂肪組織顯著減少，與正常對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 </p><p>　　線粒體是高度動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器，其形態(tài)不斷發(fā)著融合與分裂變化。線粒體形態(tài)可以呈橢圓形、長管狀、網(wǎng)絡(luò)狀，并且數(shù)量在各種形態(tài)間保持動(dòng)態(tài)平衡[10-11]。該現(xiàn)象與現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的一些線粒體形態(tài)及動(dòng)態(tài)相關(guān)基因密切相關(guān)，如 Mfn1、Mfn2、Drp1基因。本研究通過熒光定量PCR法，檢測(cè)有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)前后肥胖大

18、鼠脂肪細(xì)胞中NYGGF4基因、 Mfn1蛋白、 Mfn2蛋白、Drp1蛋白的表達(dá)水平，其中NYGGF4基因以及Mfn1蛋白在肥胖大鼠脂肪組織中顯著上調(diào)；Mfn2蛋白、Drp1蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，NYGGF4基因以及Mfn1蛋白在肥胖大鼠脂肪組織中的表達(dá)水平顯著下調(diào)；與正常對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 </p><p>　　Mfn蛋白在哺乳動(dòng)物中存在2種分子，Mfn1蛋白和Mf

19、n2蛋白。在線粒體融合過程中發(fā)揮著協(xié)同作用[12]，其中 Mfn1蛋白主要在融合的前期促進(jìn)線粒體間的彼此結(jié)合；Mfn2主要在融合反應(yīng)的后期起作用，如促進(jìn)線粒體融合，利于線粒體內(nèi)膜對(duì)接等。本結(jié)果顯示，肥胖大鼠脂肪組織中NYGGF4mRNA顯著上調(diào)，Mfn1蛋白的表達(dá)水平顯著升高；有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，肥胖組大鼠脂肪組織中NYGGF4mRNA、Mfn1蛋白的表達(dá)水平顯著降低，說明了NYGGF4mRNA可能通過上調(diào)Mfn1蛋白的表達(dá)水平，從而部分影

20、響線粒體形態(tài)及動(dòng)力學(xué)。 </p><p><b>　　參考文獻(xiàn)： </b></p><p>　　[1]Daniels SR.Complications of obesity in children and adolescents[J].Int J Obes（Lond），2009，33（1）：60-65. </p><p>　　[2]CaliA

21、M G，Caprio S.Obesity in children and adolescents [J].JClin Endocrinol M，2008，93（1）：32-36. </p><p>　　[3]Zhao YP，Zhang C M，Chen XH，et al.Overexpression of NYGGF4（ PID1） induces mitochondrial impairment in 3T3-

22、 L1 adipocytes[J].Mol Cell Biochem，2010，340（1）： 41- 48. </p><p>　　[4]沈通彥，李軍漢，黃雷. 運(yùn)動(dòng)減肥的生物學(xué)機(jī)制[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2007，11（17）：3415 -3418. </p><p>　　[5]嚴(yán)治濤，李南方.棕色脂肪的來源及形成研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，31（6）：7

23、78-781. </p><p>　　[6]Zhang CM，Chen XH，Wang B，et al. Overexpression of NYGGF4 inhabits glucose transport in 3T3 - L1 adipocytes via attenuated phosphorylation of IRS - 1 and Ak t[J].Acta Pharm acol Sin，2009，3

24、0 （1） ：120 -124. </p><p>　　[7]Kin JA，Wei Y，Sowers J R.Role of mitochondrial dysfuction in insulin resistance[J].Circ Res，2008，102 （4）：401 - 414. </p><p>　　[8]Sukhorukov VM，Bereiter - H ahn J. An

25、omalous diffusion induced by cristae geometry in the inner mitochondrial membrane[J]. PLoS One，2009，4（2）： 46-54. </p><p>　　[9]畢業(yè)，李建設(shè).有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)單純性肥胖兒童血中瘦素、神經(jīng)肽、胰島素和腫瘤壞死因子的影響研究[J].體育科學(xué)，2005，25（12）：37-39. </p>

26、<p>　　[10] Legros F，Lombes A，F(xiàn)rachon P，et al. Mitochondrial fusion in human cells is efficient，requires the inner-membrane potetia，land is mediated by mitofusins[J]. M olB iol Cel l，2002，13（12）：4343-4354. </p&g

27、t;<p>　　[11]Chen H， Detmer SA，Ewald A J，et al. Mitofusins Mfn1 and Mfn2 coordinately regulate mitochondrial fusion and are essential for embryonic development[J].J Cell Biol，2003，160（2）：189-200. </p><p&