利用褐菖鲉肝HSPs的LAMP技術(shù)快速監(jiān)測(cè)海洋石油污染的可行性研究.pdf

1、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)是一種新穎的核酸擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)以其靈敏度高、特異性強(qiáng)、反應(yīng)速度快、檢測(cè)成本低等優(yōu)點(diǎn)已廣泛應(yīng)用于各種病原體的檢測(cè)，但在環(huán)境污染監(jiān)測(cè)方面的應(yīng)用則較少。
　　 本文以我國(guó)海洋經(jīng)濟(jì)魚類褐菖鲉（Sebastiscus marmoratus）為研究對(duì)象，克隆了四種熱休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)——HS

2、P60、HSC70、HSP70和HSP90基因序列，分別建立并優(yōu)化定量LAMP技術(shù)。為驗(yàn)證定量LAMP技術(shù)的可行性，將褐菖鲉分別暴露于20μg·L-1、60μg·L-1和180μg·L-1原油水溶性成分(water soluble fraction，WSF)，第1、5、10d采樣，利用定量LAMP技術(shù)檢測(cè)肝HSPs基因的表達(dá)情況，并與Real-time PCR結(jié)果進(jìn)行比較。
　　 主要研究結(jié)果如下:
　　 (1)建立了H

3、SPs的LAMP檢測(cè)方法，并對(duì)其中的幾個(gè)重要參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，Mg2+最佳濃度為8 mmol·L-1，外引物與內(nèi)引物濃度比為1:6時(shí)效果最好，最適反應(yīng)溫度為64℃，最佳反應(yīng)時(shí)間為50 min，甜菜堿最佳濃度為0.4mol·L-1，dNTP最佳濃度為1.4 mmol·L-1。
　　 (2)本實(shí)驗(yàn)以HNB為染料，建立了定量LAMP檢測(cè)技術(shù)，對(duì)其靈敏度進(jìn)行摸索發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)限為4.74×104 copies，而Real-time

4、PCR的檢測(cè)限為2.75 copies。雖然LAMP的靈敏度低于Real-time PCR，但是LAMP反應(yīng)快，成本低，耗時(shí)短，只需簡(jiǎn)易的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，更適用于現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)。
　　 (3)原油WSF短期毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LAMP的檢測(cè)結(jié)果與Real-time PCR的基本一致，表明該方法可用于實(shí)際樣品的快速檢測(cè);不同濃度原油WSF暴露下，不同HSPs基因mRNA的表達(dá)變化趨勢(shì)不一致，其中對(duì)WSF敏感性和特異性較好的是HSP60和H