微懸臂梁陣列在細(xì)胞牽引力測(cè)量中的應(yīng)用

1、<p>　　微懸臂梁陣列在細(xì)胞牽引力測(cè)量中的應(yīng)用</p><p>　　作者：周治國(guó)，劉志文，范哲意</p><p>　　【摘要】 精確測(cè)量細(xì)胞牽引力的大小及分布對(duì)細(xì)胞生物學(xué)、組織工程等研究具有重要意義。近年來，基于生物微機(jī)電系統(tǒng)技術(shù)制作的高深寬比聚二甲基硅氧烷 (PDMS) 微懸臂梁陣列作為細(xì)胞牽引力測(cè)量傳感器受到廣泛關(guān)注。不同于傳統(tǒng)基于連續(xù)基質(zhì)的測(cè)量方法，細(xì)胞在致密、垂直、離

2、散的微懸臂梁陣列頂端貼附并延展、遷移，引起微懸臂梁形變。通過對(duì)掃描電子顯微鏡圖像處理，細(xì)胞牽引力測(cè)量精度可以達(dá)到數(shù)十 nN/m。我們綜述了基于微懸臂梁陣列細(xì)胞牽引力傳感器測(cè)量方法，重點(diǎn)論述了實(shí)驗(yàn)原理、制作工藝和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，并討論了微懸臂梁陣列結(jié)構(gòu)倒塌機(jī)理。 </p><p>　　【關(guān)鍵詞】 細(xì)胞牽引力；生物微機(jī)電系統(tǒng)；聚二甲基硅氧烷；微懸臂梁陣列；圖像處理</p><p>　　Abstra

3、ct：Cell traction forces (CTFs) precision measurement is significant for many research fields such as cell biology and tissue engineering and so on. In recent years, enabled by the advancement in the Biological Micro Elec

4、tromechanical Systems (BioMEMS) technology, high-aspect-ratio polydimethylsiloxane (PDMS) microcantilever array devices which serve as CTFs sensors have been widely concerned. Rather than conventional continuous substrat

5、es, cell attached and spread across multiple discrete </p><p>　　Key words：Cell traction force;Biological micro electromechanical systems;Polydimethylsiloxane;Microcantilever array; Image processing</p>

6、<p><b>　　1 引 言</b></p><p>　　細(xì)胞通過焦點(diǎn)粘附傳遞納牛頓量級(jí)牽引力到底層基材［1］。細(xì)胞牽引力在細(xì)胞遷移和細(xì)胞形態(tài)保持中起關(guān)鍵作用，在許多生物學(xué)過程中扮演了基礎(chǔ)角色，比如新生血管生成，胚胎形成，炎癥和傷口愈合等。過去幾十年來，許多方法用來在亞細(xì)胞層面測(cè)量細(xì)胞牽引力。根據(jù)引起細(xì)胞形變所采用的技術(shù)可以分為兩大類：主動(dòng)方法和被動(dòng)方法。主動(dòng)方法使用外力

7、使細(xì)胞產(chǎn)生形變來測(cè)量細(xì)胞牽引力，其中有原子力顯微鏡方法［2］和微吸管方法［3］；被動(dòng)方法采用傳感器來被動(dòng)探測(cè)細(xì)胞產(chǎn)生的力，包括彈性基材法［4］和微珠柵格圖案法［5-6］。原子力顯微鏡法利用固定在柔性懸臂梁上的探針來探測(cè)細(xì)胞，可以觀測(cè)細(xì)胞和探針的相對(duì)形變，以計(jì)算施加于細(xì)胞上的力大小和細(xì)胞硬度。這種方法的缺點(diǎn)是測(cè)量探針容易破壞細(xì)胞。微吸管法用微吸管吮吸細(xì)胞，由于真空吸力使細(xì)胞產(chǎn)生形變。施加的力可以通過形變量計(jì)算得出，細(xì)胞的機(jī)械特性也可以由測(cè)

8、量到的數(shù)據(jù)推算得出。彈性基材法通過人造柔性基材來測(cè)量單個(gè)細(xì)胞的牽引力。當(dāng)細(xì)胞貼附、遷移時(shí)，將產(chǎn)生牽引力并會(huì)對(duì)硅樹脂基材拉扯，通過觀測(cè)基材所造成的皺折形變來測(cè)量細(xì)胞的力學(xué)行為。這種方法存在許多測(cè)量技術(shù)上的限制，當(dāng)力作用在相同平面基材的不同方向上時(shí)</p><p>　　隨著BioMEMS 技術(shù)的進(jìn)步，近年來經(jīng)過表面處理高深寬比 PDMS 微懸臂梁陣列被開發(fā)出來作為傳感器，用來探測(cè)細(xì)胞牽引力及在體外研究細(xì)胞的機(jī)械性質(zhì)［

9、7-10］。采用微加工工藝在硅片上制作模具，復(fù)脫模法制作 PDMS 微懸臂梁陣列。細(xì)胞貼附在微懸臂梁陣列頂端，在多個(gè)微懸臂梁頂端間延展遷移，該過程會(huì)造成微懸臂梁陣列發(fā)生彎曲形變。采用這種致密、垂直、離散微懸臂梁陣列結(jié)構(gòu)替代傳統(tǒng)連續(xù)測(cè)量介質(zhì)，在基材面上，每個(gè)接觸到細(xì)胞的微懸臂梁作為獨(dú)立的力學(xué)傳感器單元來測(cè)量細(xì)胞牽引力，通過對(duì)微懸臂梁陣列形變的顯微圖像處理，細(xì)胞牽引力可以被直接定性、定量測(cè)量，精度可以達(dá)到數(shù)十 nN/μm。</p>

10、;<p><b>　　2 測(cè)量原理</b></p><p>　　圖1是細(xì)胞在微懸臂梁陣列頂端貼附、延展及微懸臂梁形變示意圖。微懸臂梁在小形變范圍內(nèi)形變可視作線性彈性形變，形變量正比于細(xì)胞牽引力。根據(jù)線性彈性理論［11］，圓柱體微懸臂梁半徑r,高度L,在外力F作用下彎曲產(chǎn)生形變，具體公式如下，其中E，K和Δx, 分別為楊氏模量，彈性常數(shù)和形變量。</p><

11、p>　　F=KΔx=(3πEr44L1)Δx(1)</p><p>　　3 PDMS微懸臂梁陣列制作過程</p><p>　　圖2展示了采用復(fù)脫模方法制作微懸臂梁陣列的關(guān)鍵步驟。</p><p>　　3.1 第一步 (圖2 A-C) 是將設(shè)計(jì)好的掩模圖案通過光刻工藝轉(zhuǎn)移到光刻膠上。Tan 等［7］采用 SU-8 (Microchem, Newton, MA

12、) 負(fù)光膠，紫外曝光及顯影后，直徑 3 μm、高度11 μm、間距 9 μm的 SU-8 垂直懸臂梁陣列豎立在硅片上，作為復(fù)脫模微模具。由于光波長(zhǎng)限制、毀壞性粘著及光膠回流等原因，采用接觸 I-line (波長(zhǎng)365 nm) 紫外軟光刻標(biāo)準(zhǔn)工藝制作尺寸更小的結(jié)構(gòu)非常困難。du Roure等［8］and Li等［9］采用正光膠和深反應(yīng)離子刻蝕 (DRIE) 工藝，在硅片上刻蝕出圓柱形孔陣列。采用這種工藝，du Roure 等制作出直徑 1

13、 μm、高度 5.2 μm、間距 3 μm的微懸臂梁陣列，這些尺寸指標(biāo)非常突出。然而該方法有兩個(gè)缺點(diǎn)，首先，深反應(yīng)離子刻蝕工藝對(duì)設(shè)備條件要求很高，對(duì)大部分研究人員而言，工藝制作費(fèi)用非常昂貴；其次，用這種方法制作的微懸臂梁不完全是圓柱體，而在理論分析中一般采用圓柱體模型，若不經(jīng)校正直接使用，會(huì)導(dǎo)致測(cè)量誤差。Addae等［10］通過消除 SU-8 和掩模之間空氣間隙的不利影響，改進(jìn)了接觸 I-line</p><p>

14、;　　3.2 第二步 (圖 2D-G) 是 PDMS 預(yù)聚物澆注，其中采用負(fù)光膠工藝需要二次澆注。首先，準(zhǔn)備 PDMS (Sylgard 184, Dow-Corning)預(yù)聚物，充分混合PDMS 及其固化劑 (體積比: 10∶1) ，置入真空泵中抽氣20 min，PDMS 預(yù)聚物澆注到硅片上的 SU-8 懸臂梁陣列微模具上，放置在熱板上，65 ℃烘烤 12 h，將 PDMS 微模具從硅片剝離，氧離子處理 1 min，脫模劑蒸熏 12

15、 h，以利于后續(xù) PDMS 微懸臂梁陣列從 PDMS 微模具上分離。 然后，將PDMS 預(yù)聚物澆注到 PDMS 微模具中，置入真空泵抽氣 20 min，110 ℃烘烤20 h，從 PDMS 模上剝離 PDMS 微懸臂梁陣列。對(duì)于采用 DRIE 工藝直接硅片刻蝕生成的微模具，硅片先經(jīng)過硅烷化處理以易于后期脫模，然后將PDMS 預(yù)聚物澆注到硅片微模具，65℃烘烤 12 h，從硅模上剝離。</p><p>　　3.3

16、 第三步 (圖2 H-I) 是微懸臂梁頂端表面處理。PDMS 微懸臂梁陣列脫模后，氧離子表面處理使其親水。為進(jìn)行下一步細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，采用微接觸印刷方法［12］ ，在PDMS 微懸臂梁陣列預(yù)定區(qū)域印刷上經(jīng)過熒光標(biāo)記的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)。Addae等［10］采用量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)可以在標(biāo)準(zhǔn)熒光顯微鏡下跟蹤微懸臂梁形變得到更精確的位移信息，使微分干涉差顯微鏡產(chǎn)生的懸臂梁頂端和細(xì)胞邊緣模糊問題最小化，并消除了信號(hào)衰減的時(shí)間依賴性。</p>

17、<p>　　力測(cè)量實(shí)驗(yàn)的掃描電子顯微鏡 (SEM) 照片，采用同一標(biāo)尺合成在一起以便于比較。Tan 等設(shè)計(jì)了 mPADs (microfabricated post-array-detectors)，直徑 3 μm、高度 11 μm、間距 9 μm，相對(duì)應(yīng)每根懸臂梁可以達(dá)到 32 nN/μm 精度［7］。采用 DRIE 方法，du Roure 等制作出 μFSA (microdimensional force sensor a

18、rray) ，直徑 1 μm、高度 5.2 μm、間距 3 μm，深寬比接近 6，這是目前采用 PDMS 微懸臂梁陣列方法測(cè)量細(xì)胞牽引力所報(bào)道的最高深寬比值，力學(xué)測(cè)量精度可以達(dá)到 21.8nN/μm［8］。MFSA (micropost force sensor array) 由Li 等開發(fā)，直徑 2 μm、高度 6 μm、間距 4 μm，深寬比為3。結(jié)合圖像處理算法，MFSA 可以達(dá)到 40 nm 分辨率和 0.5 nN 力學(xué)靈敏度［

19、9］。BoN (bed of nails) 由 Addae-Mensah等研制，直徑 2 μm、高度 7 μm、間距 5 μm，深寬比為 3.</p><p><b>　　4 討論</b></p><p>　　根據(jù)公式 (1) ，更高深寬比的微懸臂梁可以帶來更高的力學(xué)分辨率。實(shí)際上研究者們已經(jīng)嘗試提高工藝水平來制作更高深寬比的微懸臂梁陣列。比如直徑 1 μm，高度

20、20 μm，深寬比為 20 的微懸臂梁，當(dāng) PDMS 楊氏模量為 2 MPa 時(shí)，理論上對(duì)應(yīng)精度為 0.04 nN/μm。如此高的力學(xué)分辨率確實(shí)不錯(cuò)，但直覺告訴我們，過高的深寬比結(jié)構(gòu)會(huì)造成機(jī)械穩(wěn)定性問題。文獻(xiàn)［13-15］ 顯示幾何結(jié)構(gòu)一致的高深寬比 PDMS 懸臂梁會(huì)造成機(jī)械穩(wěn)定性問題，如側(cè)面倒塌和觸底倒塌。側(cè)面倒塌指多個(gè)微懸臂梁倒塌導(dǎo)致互相之間粘連，觸底倒塌指單個(gè)微懸臂梁倒塌與基底之間粘連?；?Hui 的倒塌模型理論［16］，高深

21、寬比結(jié)構(gòu)倒塌是由于自身重量所引起。但根據(jù)重力引起倒塌理論，目前尺寸條件下所有制作的 PDMS 微懸臂梁都不應(yīng)該有穩(wěn)定性問題，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果事與愿違。文獻(xiàn)［17］指出，由于 PDMS 楊氏模量限制，在空氣中 PDMS 微懸臂梁的臨界深寬比在 6 左右。即使增加 PDMS 預(yù)聚體的烘烤時(shí)間或改變 PDMS 與固化劑的混合比率，楊氏模量不會(huì)發(fā)生顯著改變［18］。</p><p>　　我們發(fā)現(xiàn)在溶液中，PDMS微懸臂梁臨界深

22、寬比可以提高。實(shí)際上，在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，粘附有細(xì)胞的微懸臂梁是浸沒在培養(yǎng)基溶液中。因此，我們可以在溶液環(huán)境中制作微懸臂梁陣列以提高深寬比。我們?cè)O(shè)計(jì)了實(shí)驗(yàn)在溶液環(huán)境下制作微懸臂梁陣列并將其浸沒在不同的溶液中，如乙醇和水中來考察其機(jī)械穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)表明，如果我們可以避免液體蒸發(fā)，打破微懸臂梁頂端液體表面張力平衡，微懸臂梁陣列可以保持直立穩(wěn)定。溶液表面能越低，臨界深寬比就越高，在水溶液中可以得到深寬比為 10 左右的微懸臂梁陣列。即使一些未知擾動(dòng)，

23、如碰撞，流體表面張力等，不會(huì)導(dǎo)致微懸臂梁粘連倒塌。</p><p><b>　　5 結(jié)論</b></p><p>　　細(xì)胞牽引力細(xì)節(jié)知識(shí)對(duì)理解生物過程有著重要意義已成為共識(shí)。采用經(jīng)過表面處理的高深寬比 PDMS 微懸臂梁陣列作為傳感器，用來探測(cè)細(xì)胞牽引力，可以得到數(shù)十 nN/m 的分辨率。我們?cè)敱M地綜述了采用 BioMEMS 工藝制作 PDMS 微懸臂梁矩陣的方法。

24、對(duì)測(cè)量原理和模型，制作技術(shù)流程，表面處理，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)等逐一詳細(xì)論述。BioMEMS 制造工藝發(fā)展迅速，雖然還有很多不足之處需要我們?nèi)ネ晟疲錇榧?xì)胞力學(xué)測(cè)量領(lǐng)域提供了非常多的機(jī)會(huì)和方法值得我們?nèi)ヌ剿鳌?lt;/p><p>　　本工作由國(guó)家留學(xué)基金委支持，作者在此感謝北京理工大學(xué)生命信息實(shí)驗(yàn)室和美國(guó)哥倫比亞大學(xué)生物微機(jī)電系統(tǒng)和微流控實(shí)驗(yàn)室人員的幫助。</p><p><b>　　【參考文

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