糟醉帶魚中具抗氧化性乳酸菌的分離、篩選和鑒定【開題報(bào)告+文獻(xiàn)綜述+畢業(yè)設(shè)計(jì)】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文系列</b></p><p><b>　　開題報(bào)告</b></p><p><b>　　食品科學(xué)與工程</b></p><p>　　糟醉帶魚中具抗氧化性乳酸菌的分離、篩選和鑒定</p><p>　　一、選題的背景與意義</p>

2、;<p>　　在我國，糟醉魚作為一類傳統(tǒng)食品在民間廣為流行，其有開肺之功、健脾之效。酒糟魚產(chǎn)品中含有蛋白質(zhì)、淀粉、粗纖維、脂肪、氨基酸、聚戊糖、灰分以及豐富的維生素、生長素等物質(zhì)，還含有豐富的鈣、磷、碘、鋅、硒等多種礦物質(zhì)及微量元素，以及發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酵母菌、多種清香醇甜因子等，且具有酒香味、米香味、臘香味，三味香氣匯成一體，肉質(zhì)緊密，富有彈性，有咬勁，色澤美麗，香氣濃郁，久食不厭，經(jīng)常食用可增強(qiáng)鈣的吸收，促進(jìn)身體強(qiáng)壯，

3、營養(yǎng)價(jià)值大，含量穩(wěn)定，開發(fā)利用價(jià)值高，一直受到人們的青睞。 </p><p>　　酒糟魚之所以具有獨(dú)特的風(fēng)味，是多種微生物混合作用的結(jié)果，這些微生物多為常見的細(xì)菌、霉菌、酵母菌等?，F(xiàn)食品領(lǐng)域?qū)ξ⑸锏难芯咳諠u成熟，各種微生物的分離與篩選及鑒定的方法也越來越多。制備純菌菌液制作發(fā)酵食品，不但可以達(dá)到規(guī)模化生產(chǎn)，使產(chǎn)品品質(zhì)穩(wěn)定，而且可縮短發(fā)酵食品加工時(shí)間，從而降低生產(chǎn)成本。</p><p

4、>　　其中的乳酸菌對(duì)酒糟魚的品質(zhì)有很大的影響。乳酸菌是指一群通過發(fā)酵糖類產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌總稱。在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等與人類生活密切相關(guān)的重要領(lǐng)域應(yīng)用價(jià)值較高,廣泛應(yīng)用于乳制品、蔬菜及肉制品的發(fā)酵與防腐中。</p><p>　　水產(chǎn)品等的化學(xué)變質(zhì)發(fā)生在水產(chǎn)品的脂類部分，以自動(dòng)氧化為主。水產(chǎn)品變質(zhì)是指引起水產(chǎn)品組織變褐、變黃的過氧化物形成，它們進(jìn)一步氧化分解產(chǎn)生醛和酮， 進(jìn)而產(chǎn)生強(qiáng)烈的油哈喇味。目前預(yù)防食品氧化

5、主要通過添加一些抗氧化劑，如BHA、BHT、PG、TBHQ 和VE等，但存在使用成本高， 抗氧化性能弱以及近年來在毒理研究中確認(rèn)的安全性問題等。此外，在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中，加熱等處理方法可導(dǎo)致抗氧化劑分解或揮發(fā)等損耗，故只能在加工后加入抗氧化劑。然而許多產(chǎn)品的脂肪氧化在加工過程中就已經(jīng)開始。因此，開發(fā)安全無毒、價(jià)格低廉并且可貫穿整個(gè)加工過程的優(yōu)質(zhì)天然抗氧化物成為研究熱點(diǎn)。</p><p>　　乳酸菌的抗氧化活性已經(jīng)得

6、到體內(nèi)及體外試驗(yàn)的證實(shí)。乳酸菌具有天然無毒、保健的特性，在相關(guān)食品加工過程中應(yīng)用廣泛， 勢必成為人們首選的新型抗氧化劑。</p><p>　　二、研究的基本內(nèi)容與擬解決的主要問題：</p><p>　　糟醉帶魚中的分離乳酸菌。</p><p>　　篩選出具有高抗氧化活性的乳酸菌菌株。</p><p>　　對(duì)高抗氧化活性乳酸菌菌株進(jìn)行鑒定。&l

7、t;/p><p>　　三、研究的方法與技術(shù)路線：</p><p><b>　　研究方法</b></p><p>　　1、用傳統(tǒng)方法制作糟醉帶魚；</p><p>　　2、用MRS培養(yǎng)基分離出乳酸菌；</p><p>　　3、以對(duì)超氧陰離子自由基清除率及抗脂質(zhì)過氧化率等為指標(biāo)篩選出具有高抗氧化活性的乳酸

8、菌菌株；</p><p>　　4、對(duì)篩選出的乳酸菌進(jìn)行鑒定。</p><p><b>　　技術(shù)路線</b></p><p>　　四、研究的總體安排與進(jìn)度：</p><p>　　2010.10.01-2010.11.31 查閱資料，完成開題報(bào)告、文獻(xiàn)綜述；</p><p>　　2010.12.0

9、1-2011.01.15 開題論證，2篇外文翻譯，實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作；</p><p>　　2011.01.16-2011.04.20 分離乳酸菌，篩選鑒定具高抗氧化活性的乳酸菌株，數(shù)據(jù)整理、補(bǔ)充；</p><p>　　2011.04.21-2011.05.10 整理數(shù)據(jù)，書寫論文，完成答辯。</p><p><b>　　主要參考文獻(xiàn)：</b&

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22、7,02:242-244.</p><p><b>　　畢業(yè)論文文獻(xiàn)綜述</b></p><p><b>　　食品科學(xué)與工程</b></p><p>　　食品中乳酸菌抗氧化活性的研究</p><p>　　摘要 許多乳酸菌能產(chǎn)生多種具有抑菌或殺菌生物活性物質(zhì)，在抑制各種病原菌和食物腐敗等方面起重要作用

23、。其中乳酸菌的抗氧化活性開始引起國內(nèi)外大量專家學(xué)者的廣泛關(guān)注，其抗氧化活性已經(jīng)得到體內(nèi)及體外試驗(yàn)的證實(shí)。關(guān)于其抗氧化機(jī)理和檢測方法也有很多不同的論點(diǎn)。乳酸菌具有天然無毒、保健的特性，在相關(guān)食品加工過程中應(yīng)用廣泛， 勢必成為人們首選的新型抗氧化劑。</p><p>　　關(guān)鍵字 乳酸菌 抗氧化活性 作用機(jī)理 檢測方法</p><p><b>　　0 引言</b></

24、p><p>　　乳酸菌是指一群通過發(fā)酵糖類產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌總稱。從形態(tài)上可分為球菌和桿菌，并且多數(shù)為革蘭氏染色呈陽性、不形成芽孢、不運(yùn)動(dòng)、過氧化氫酶試驗(yàn)呈陰性、對(duì)葡萄糖發(fā)酵能產(chǎn)生50％ 以上乳酸、而且在缺少氧氣的環(huán)境中生長良好的兼性厭氧性細(xì)菌[1]。在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等與人類生活密切相關(guān)的重要領(lǐng)域應(yīng)用價(jià)值較高，廣泛應(yīng)用于乳制品、蔬菜及肉制品的發(fā)酵與防腐中。</p><p>　　許多乳酸菌除產(chǎn)

25、生乳酸、乙酸、雙乙酰和過氧化氫外，還能產(chǎn)生多種具有抑菌或殺菌生物活性物質(zhì)，在抑制各種病原菌和食物腐敗等方面起重要作用，尤其是作為益生菌的重要成員之一倍受各界關(guān)注[2]。</p><p>　　近年來，國內(nèi)外對(duì)乳酸菌的生理活性有大量的研究報(bào)道。其中，乳酸菌的抗氧化活性也開始引起國內(nèi)外大量專家學(xué)者的廣泛關(guān)注。</p><p>　　1 乳酸菌的抗氧化活性研究意義</p><p&

26、gt;　　生物氧化是生命有機(jī)體的一個(gè)重要生理過程，通過生命氧化可以為生命提供能量。但是在生命氧化過程中會(huì)產(chǎn)生自由基等活性分子，這可能會(huì)引起生物大分子的損傷，從而導(dǎo)致一些疾病如癌癥、肺氣腫、動(dòng)脈粥樣硬化、肝硬化、關(guān)節(jié)炎、心血管疾病以及衰老[3]。因此開發(fā)不同來源的抗氧化劑對(duì)清除氧自由基、保護(hù)細(xì)胞和組織免受損傷是一個(gè)非常有意義的研究課題。</p><p>　　現(xiàn)今，大部分的抗氧化劑來自化學(xué)合成和天然物質(zhì)的提取物。隨著

27、科學(xué)的進(jìn)步，越來越多的人認(rèn)識(shí)到化學(xué)合成抗氧化劑的危害，而天然物質(zhì)的提取又因?yàn)榧兓?、?fù)配、改性等問題的限制，阻礙了其發(fā)展[4]。</p><p>　　微生物資源豐富。生產(chǎn)周期短，原料低廉，微生物發(fā)酵法在將來很可能成為大規(guī)模獲得食用抗氧化劑的一條有效途徑。故而乳酸菌以其生產(chǎn)周期短，原料低廉，可通過發(fā)酵法大規(guī)模獲得等顯而易見的優(yōu)勢，成為更具競爭力和市場的新型抗氧化劑[5]。國外正在將具有抗氧化活性的乳酸菌應(yīng)用于功能食品

28、的開發(fā)和生產(chǎn)。</p><p>　　2 乳酸菌抗氧化機(jī)理</p><p>　　乳酸菌抗氧化機(jī)理現(xiàn)在還沒有定論，有研究表明可能包括金屬離子螯合能力、活性氧的清除、酶活性控制和乳酸菌的還原活性等[6-12]。</p><p>　　2.1 螯合金屬離子與活性氧的清除</p><p>　　眾所周知，氧氣分子活性很低，在代謝過程中由氧氣到水的過程，會(huì)形

29、成活性氧中間產(chǎn)物如：超氧陰離子（O2-.）、H2O2和羥基自由基（HO.）[7]。O2-和H2O2通過Fenton和Haber-Weiss反應(yīng)形成活性更高的HO.。</p><p>　　通過螯合金屬離子，可以有效地防止高活性氧的生成，減少不良氧化反應(yīng)的進(jìn)行。除了直接清除，阻止HO.毒性的產(chǎn)生可以通過降低羥基自由基前體（如鐵）的含量來實(shí)現(xiàn)[8]。</p><p>　　H2O2是一種弱氧化劑，

30、但它有較高的擴(kuò)散性和較長的半衰期。由于這兩種基本的特性，過氧化氫可以直接產(chǎn)生氧化損害， 也可以作為OH.的前體對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生氧化危害。因此有效清除H2O2也是減少氧化損害的有效手段。</p><p>　　2.2 酶活性的影響</p><p>　　當(dāng)異常高的活性氧生成時(shí)， 氧化應(yīng)激（oxidative stress）產(chǎn)生了，這會(huì)導(dǎo)致DNA、蛋白質(zhì)和脂類物質(zhì)發(fā)生損害。真核生物和好氧的原核生物都具有

31、全面的抗氧化防御機(jī)制以減輕ROS的損害。這種防御機(jī)制包括還原型谷胱甘肽和抗氧化酶，其中抗氧化酶包括SOD、GSH-Px、過氧化氫酶（CAT）和硫氧還蛋白還原酶。</p><p>　　2.2.1 還原型谷胱甘肽GSH</p><p>　　谷胱甘肽是除古菌外的微生物細(xì)胞內(nèi)最主要的非蛋白巰基化合物，其直接或間接參與微生物細(xì)胞的許多生命活動(dòng)，其中最主要的作用之一就是與相關(guān)代謝酶類共同筑成一道強(qiáng)有力

32、的抗氧化脅迫線。</p><p>　　Sule Coskun[9]等人用保加利亞乳桿菌B3和A13的菌懸液（1010mL-1）灌胃小鼠14 d，小鼠小腸內(nèi)GSH的含量由7.8μmol/g分別提高到9.5μmol/g和10.7μmol/g， 從而提高了小鼠小腸內(nèi)非酶抗氧化能力。</p><p><b>　　2.2.2 SOD</b></p><p&g

33、t;　　大多數(shù)乳酸菌是通過產(chǎn)SOD酶和谷胱甘肽而清除羥自由基和過氧化氫的。而SOD酶能直接減少活性氧自由基的毒性，并阻止活性氧自由基向羥自由基的轉(zhuǎn)變。SOD消除O2-對(duì)乳酸菌的毒害作用是通過清除超氧化物自由基來實(shí)現(xiàn)的，歧化反應(yīng)如下：O2-+ O2-+2H+→H2O2+O2[10]。</p><p>　　2.3 乳酸菌的還原活性</p><p>　　Lin等[11]研究中報(bào)道，在對(duì)19株乳酸

34、菌包括嗜酸乳桿菌(L . acidophilus)，保加利亞乳桿菌(L．bulgaricus)，嗜熱鏈球菌(St. thermophilus)，長雙歧桿菌(B. 1ongum)的一些菌株的無細(xì)胞提取物進(jìn)行抗氧化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，所有的被研究菌株對(duì)抗壞血酸的自動(dòng)氧化具有抑制作用，抑制的范圍在7％-12％；在金屬離子螫合能力方面，1010個(gè)活乳酸菌的無細(xì)胞提取物可螫合Fe的量為(2.5-72.7)*10-6，其中嗜熱鏈球菌821為72.7*10-6

35、。在清除HO.實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，1010個(gè)活乳酸菌的無細(xì)胞提取物清除HO.能力相當(dāng)于尿酸的量為0.5-33.1 mmol／L，其中嗜酸乳桿菌E為33.1 mmol／L。這19株乳酸菌都具有還原能力，但均沒有發(fā)現(xiàn)SOD酶的活性。</p><p>　　Lin[12]等還在抗脂質(zhì)過氧化實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，嗜酸乳桿菌與長雙歧桿菌的無細(xì)胞提取物對(duì)亞油酸過氧化反應(yīng)的抑制率為33％-46％；對(duì)造骨細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的抑制率為22％-37％

36、，對(duì)熒光組織色素積累的抑制率為20％-39％；1 mL無細(xì)胞提取物的抗氧化活性的效果相當(dāng)(104-172)*10-6丁基化羥基甲苯(BHT)。嗜酸乳桿菌與長雙歧桿菌的無細(xì)胞提取物都具有清除膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)物MDA的能力，但對(duì)叔丁基過氧化氫并無清除能力。</p><p>　　由此可見，乳酸菌確實(shí)具有抗氧化活性。</p><p>　　3 乳酸菌抗氧化活性的檢測方法</p>&l

37、t;p>　　乳酸菌的抗氧化能力已經(jīng)得到大量實(shí)驗(yàn)的證實(shí)，在其抗氧化活性的檢測上面也有多種不同的方法，主要包括清除超氧陰離子自由基的能力、抗脂質(zhì)過氧化法、清除羥自由基的能力、清除二苯基苦基苯肼自由基的能力等[13-16]。</p><p>　　3.1 清除超氧陰離子自由基的能力</p><p>　　測定乳酸菌清除超氧陰離子自由基一般采用鄰苯三酚自動(dòng)氧化的比色分析法。</p>

38、<p>　　鄰苯三酚在堿性條件下自動(dòng)氧化并產(chǎn)生超氧陰離子自由基和有色中間產(chǎn)物，加入超氧陰離子自由基清除物質(zhì)后會(huì)抑制有色中間產(chǎn)物的產(chǎn)生，可以通過比色的方法進(jìn)行定性和定量分析。因而可以根據(jù)加入乳酸菌菌體或其無細(xì)胞提取物前后有色中間物質(zhì)顏色的變化來反映超氧陰離子自由基的生成與減少[17]。</p><p>　　雖然超氧陰離子自由基不能直接誘導(dǎo)生物和食品體系中的脂類氧化，但它會(huì)在金屬離子催化下發(fā)生Fenton

39、反應(yīng)產(chǎn)生具有高活性的羥自由基，因此常用樣品對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力來反映其抗氧化活性[18]。</p><p>　　3.2 抗脂質(zhì)過氧化法</p><p>　　脂質(zhì)過氧化反應(yīng)是自由基攻擊細(xì)胞膜上的多聚不飽和脂肪酸(PUFA)而觸發(fā)脂質(zhì)過氧化(LPO )等一系列鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。</p><p>　　目前檢測乳酸菌抗脂質(zhì)過氧化的常用方法是硫代巴比妥酸(TBA)法，脂質(zhì)過氧

40、化反應(yīng)的最終產(chǎn)物有丙二醛(M DA) 。MDA可破壞蛋白質(zhì)等生物大分子，造成機(jī)體老化和多種疾病的發(fā)生，其含量與多種疾病的發(fā)生及年齡的增長呈正相關(guān)，其性質(zhì)比較穩(wěn)定，便于檢測。因此，測定M DA的含量，在一定程度上可反映脂質(zhì)過氧化損傷的程度，是目前公認(rèn)的反映脂質(zhì)過氧化的指標(biāo)[19]。</p><p>　　丙二醛在酸性條件下可以與硫代巴比妥酸(TBA)反應(yīng)(室溫反應(yīng)5 h，不時(shí)搖動(dòng))生成紅棕色的三甲川，在532 nm處

41、有吸收峰．可以計(jì)算出MDA的量，從而得知脂質(zhì)過氧化的情況[19]。為避免過量的氧化物使三甲川褪色，可在加入TBA以前，加入三氯醋酸或丁基化羥基甲苯阻斷反應(yīng)。</p><p>　　TBA法常用于檢測乳酸菌是否對(duì)生物體系(如紅細(xì)胞、脂蛋白、組織勻漿、肝微粒體、肝線粒體、肝細(xì)胞等)具有抗脂質(zhì)過氧化作用。</p><p>　　3.3 清除羥自由基的能力</p><p>　　

42、生命活動(dòng)的代謝過程所產(chǎn)生的自由基中，羥自由基是體內(nèi)最活潑的活性氧，氧化能力極強(qiáng)。因此迫切需要加強(qiáng)清除羥自由基作用的研究。</p><p>　　產(chǎn)生羥自由基的體系主要是Fenton體系，其他還有Fe3+—EDTA-Vc—H2O2體系、黃嘌呤一黃嘌呤氧化酶一H2O2體系、紫外光照H2O2光解也可產(chǎn)生羥自由基[20]。其中Fenton體系是最常用的。</p><p>　　鄰二氮菲—Fe2+是一常

43、用的氧化還原指示劑，其顏色變化可敏銳地反映溶液氧化還原狀態(tài)的改變[21]。H2O2與Fe2+通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基是一強(qiáng)氧化劑。鄰二氮菲一Fe2+水溶液被羥自由基氧化為鄰二氮菲一Fe3+后，其在536nm處的最大吸收減少。加入羥自由基清除劑后，羥自由基的濃度減小，體系的吸光度會(huì)再次升高到一定程度。</p><p>　　因此可以根據(jù)加入乳酸菌菌體或其無細(xì)胞提取物前后吸光度的變化來反映羥自由基的生成與減少

44、。</p><p>　　4 乳酸菌抗氧化性應(yīng)用</p><p>　　4.1 食品的抗氧化</p><p>　　由于大部分具有抗氧化性的乳酸菌都是食源性的，因此在食品中應(yīng)用節(jié)省了相關(guān)的毒理學(xué)驗(yàn)證。</p><p>　　有實(shí)驗(yàn)表明應(yīng)用于奶酪的生產(chǎn)，生產(chǎn)中菌種保持了其益生的特性，同時(shí)具有抗氧化和抑菌特性[22]；如果應(yīng)用于涂抹軟質(zhì)干酪，可以減少化學(xué)

45、抗氧化劑的添加量[23]。</p><p>　　4.2 人類疾病的治療</p><p>　　由于自由基能夠引起人類疾病，乳酸菌能夠通過清除自由基和抑制脂質(zhì)氧化起到治療疾病的目的。</p><p>　　例如，乳酸菌對(duì)人類結(jié)腸細(xì)胞氧化損害的保護(hù)作用，從而為治療人類炎性腸病和結(jié)腸癌提供了良好的原料[24]；另外，其對(duì)減輕肝失調(diào)具有一定的作用，從而對(duì)人體健康有益：其具有清除

46、ROS的能力，ROS容易對(duì)機(jī)體產(chǎn)生氧化損害，肺氣腫、動(dòng)脈粥樣硬化、肝硬化和關(guān)節(jié)炎等疾病都與氧化損害有關(guān)[25]。</p><p><b>　　5 總結(jié)</b></p><p>　　研究已經(jīng)證實(shí)． 一些乳酸菌菌株具有抗氧化活性。雖然乳酸菌的抗氧化活性已經(jīng)得到體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的證實(shí)， 但其抗氧化活性作用機(jī)制至今尚不清楚。關(guān)于乳酸菌中的抗氧化物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、在腸道中的吸

47、收，以及在體內(nèi)所起的抗氧化機(jī)制還需要做進(jìn)一步的研究。</p><p>　　但是乳酸菌的抗氧化能力目前還不能和一些天然的抗氧化物質(zhì)如抗壞血酸相比，因此如何通過分子手段篩選和重組成新的具有高抗氧化性的乳酸菌成為其在工業(yè)化生產(chǎn)中應(yīng)用的關(guān)鍵。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 霍貴成.乳酸菌的研究與應(yīng)用[M].北

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62、:1-7.</p><p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計(jì)</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　糟醉帶魚中具抗氧化性乳酸菌的分離、篩選和鑒定</p><p><b>　　目錄</b></p><p><b&g

63、t;　　1 前言14</b></p><p>　　2 材料與設(shè)備15</p><p>　　2.1 原材料15</p><p><b>　　2.2 試劑15</b></p><p>　　2.3 儀器與設(shè)備15</p><p>　　2.4 培養(yǎng)基16</p>&l

64、t;p><b>　　3 試驗(yàn)方法16</b></p><p>　　3.1 糟醉帶魚的制作16</p><p>　　3.1.1 甜酒釀的制作16</p><p>　　3.1.2 糟醉帶魚的制作工藝17</p><p>　　3.2 乳酸菌的分離、純化17</p><p&

65、gt;　　3.2.1 分離17</p><p>　　3.2.2 純化17</p><p>　　3.3 具抗氧化性的乳酸菌的篩選17</p><p>　　3.4 菌種的鑒定18</p><p>　　3.4.1 形態(tài)學(xué)觀察18</p><p>　　3.4.2 生理生化特征18</p><p&

66、gt;　　3.4.3 分子生物學(xué)鑒定18</p><p><b>　　4結(jié)果與討論20</b></p><p>　　4.1 糟醉魚樣品中乳酸菌的分離與純化20</p><p>　　4.2 具抗氧化性乳酸菌的篩選21</p><p>　　4.3 具抗氧化性乳酸菌的鑒定23</p><p>

67、　　4.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定23</p><p>　　4.3.2 理化鑒定23</p><p>　　4.3.3 分子生物學(xué)鑒定24</p><p><b>　　5 小結(jié)24</b></p><p>　　致謝錯(cuò)誤!未定義書簽。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)24</b

68、></p><p>　　摘要： 糟醉帶魚作為傳統(tǒng)食品廣為流傳，但因其使用傳統(tǒng)加工工藝，使產(chǎn)業(yè)發(fā)展受到制約。本試驗(yàn)從糟醉魚中分離出乳酸菌，并以抗脂質(zhì)過氧化率及與維生素E相比的抑制率為指標(biāo)，用硫代巴比妥酸法篩選出具抗氧化性的菌株。結(jié)果表明：從糟醉帶魚及其他糟醉魚產(chǎn)品中共分離40個(gè)菌株，其中11株具抗氧化性，通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征和分子生物學(xué)鑒定，證實(shí)這11個(gè)菌株均為耐久腸球菌 （Enterococcus

69、durans）。這些菌株有可能應(yīng)用于糟醉帶魚的生產(chǎn)中，將能到防止氧化、改善品質(zhì)的效果。</p><p>　　關(guān)鍵詞： 乳酸菌；糟醉帶魚；篩選；抗氧化</p><p>　　Abstract: Salted and fermented hairtail with rice is one of popular traditional foods , but the traditional pro

70、cessing technology has restricted the development . The lactic acid bacteria stains was separated ,and the lactic acid bacteria stains with antioxidative activity was screeninged, sed the TBA method to the resistance of

71、lipid peroxidation rate and the inhibition ratio with Vitamin E as the indexs . 40 lactic acid bacteria stains was separated, and 11 lactic acid bacteria stains have the</p><p>　　Keywords: lactic acid bacter

72、ia ; salted and fermented hairtail with rice ; screening; antioxidation </p><p><b>　　1 前言</b></p><p>　　在我國，糟醉魚作為一類傳統(tǒng)食品在民間廣為流行。在我國，糟醉魚作為一類傳統(tǒng)食品在民間廣為流行，其有開肺之功、健脾之效。酒糟魚產(chǎn)品中含有蛋白質(zhì)、淀粉、粗纖維、脂肪

73、、氨基酸、聚戊糖、灰分以及豐富的維生素、生長素等物質(zhì)，還含有豐富的鈣、磷、碘、鋅、硒等多種礦物質(zhì)及微量元素，以及發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酵母菌、多種清香醇甜因子等，且具有酒香味、米香味、臘香味，三味香氣匯成一體，肉質(zhì)緊密，富有彈性，有咬勁，色澤美麗，香氣濃郁，久食不厭，經(jīng)常食用可增強(qiáng)鈣的吸收，促進(jìn)身體強(qiáng)壯，營養(yǎng)價(jià)值大，含量穩(wěn)定，開發(fā)利用價(jià)值高，一直受到人們的青睞[1]。其中，帶魚資源豐富，因此糟醉帶魚產(chǎn)品很是豐富。 </p>

74、;<p>　　但是現(xiàn)有的方法仍為傳統(tǒng)的糟制方法。傳統(tǒng)的酒糟魚以家庭作坊式生產(chǎn)為主，加工時(shí)間長，生產(chǎn)批量小，效率低下。受到生產(chǎn)條件和技術(shù)水平的限制，傳統(tǒng)生產(chǎn)方式生產(chǎn)出來的酒糟魚產(chǎn)品存在含鹽量高、脂肪氧化過度等質(zhì)量問題，且不同批次的產(chǎn)品在風(fēng)味和品質(zhì)上存在明顯差異，難以形成統(tǒng)一的生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)，亟需改進(jìn)。</p><p>　　糟醉魚之所以具有獨(dú)特的風(fēng)味，是多種微生物混合作用的結(jié)果，這些微生物多為常見的細(xì)菌、霉菌

75、、酵母菌等?，F(xiàn)在食品領(lǐng)域?qū)ξ⑸锏难芯咳諠u成熟，各種微生物的分離與篩選及鑒定的方法也越來越多。制備純菌菌液制作發(fā)酵食品，不但可以達(dá)到規(guī)?；a(chǎn)，使產(chǎn)品品質(zhì)穩(wěn)定，而且可縮短發(fā)酵食品加工時(shí)間，從而降低生產(chǎn)成本。</p><p>　　其中的乳酸菌對(duì)糟醉魚的品質(zhì)有很大的影響。引起水產(chǎn)品變質(zhì)的主要原因是脂肪的氧化，目前預(yù)防食品氧化主要通過添加一些抗氧化劑，如BHA、BHT、PG、TBHQ 和VE等，但存在使用成本高，抗氧化

76、性能弱以及近年來在毒理研究中確認(rèn)的安全性問題等。此外，在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中，加熱等處理方法可導(dǎo)致抗氧化劑分解或揮發(fā)等損耗，故只能在加工后加入抗氧化劑。然而許多產(chǎn)品的脂肪氧化在加工過程中就已經(jīng)開始。因此，開發(fā)安全無毒、價(jià)格低廉并且可貫穿整個(gè)加工過程的優(yōu)質(zhì)天然抗氧化物成為研究熱點(diǎn)。</p><p>　　微生物資源豐富。生產(chǎn)周期短，原料低廉，微生物發(fā)酵法在將來很可能成為大規(guī)模獲得食用抗氧化劑的一條有效途徑。故而乳酸菌以其生

77、產(chǎn)周期短，原料低廉，可通過發(fā)酵法大規(guī)模獲得等顯而易見的優(yōu)勢，成為更具競爭力和市場的新型抗氧化劑[2]。國外正在將具有抗氧化活性的乳酸菌應(yīng)用于功能食品的開發(fā)和生產(chǎn)。</p><p>　　乳酸菌是指一群通過發(fā)酵糖類產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌總稱。在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等與人類生活密切相關(guān)的重要領(lǐng)域應(yīng)用價(jià)值較高，廣泛應(yīng)用于乳制品、蔬菜及肉制品的發(fā)酵與防腐中。許多乳酸菌除產(chǎn)生乳酸、乙酸、雙乙酰和過氧化氫外，還能產(chǎn)生多種具有抑菌或殺菌

78、生物活性物質(zhì)，在抑制各種病原菌和食物腐敗等方面起重要作用，尤其是作為益生菌的重要成員之一倍受各界關(guān)注[3]。近年來，國內(nèi)外對(duì)乳酸菌的生理活性有大量的研究報(bào)道。其中，乳酸菌的抗氧化活性也開始引起國內(nèi)外大量專家學(xué)者的廣泛關(guān)注。</p><p>　　乳酸菌抗氧化機(jī)理現(xiàn)在還沒有定論，有研究表明可能包括金屬離子螯合能力、活性氧的清除、酶活性控制和乳酸菌的還原活性等。ATHIN[4]的實(shí)驗(yàn)表明，可以通過螯合離子防止高活性氧的

79、生成，減少氧化反應(yīng)不良效果；除此之外，也可以通過降低羥基自由基前體的含量來阻止羥基自由基毒性的產(chǎn)生。Sule Coskun[5]等人用保加利亞乳桿菌菌懸液灌胃小鼠14天，提高了小鼠小腸內(nèi)非酶抗氧化能力。Lin等[6]研究中報(bào)道，在對(duì)19株乳酸菌包括嗜酸乳桿菌(L. acidophilus)，保加利亞乳桿菌(L. bulgaricus)，嗜熱鏈球菌(St. thermophilus)，長雙歧桿菌(B. 1ongum)的一些菌株的無細(xì)胞提取

80、物進(jìn)行抗氧化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，所有的被研究菌株對(duì)抗壞血酸的自動(dòng)氧化具有抑制作用；活乳酸菌的無細(xì)胞提取物可螫合鐵離子。在清除羥基自由基實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，活乳酸菌的無細(xì)胞提取物具有清除羥基自由基能力。Lin[7]等還在抗脂質(zhì)過氧化實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，嗜酸乳桿菌與長雙歧桿菌的無細(xì)胞提取物對(duì)亞油酸過氧化反應(yīng)、對(duì)熒光組織色素積累的抑制率、對(duì)造骨細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)均具有抑制率；嗜酸乳桿菌與長雙歧桿菌的無細(xì)胞提取物都具</p><p>　　乳酸菌

81、的抗氧化能力已經(jīng)得到大量實(shí)驗(yàn)的證實(shí)，在其抗氧化活性的檢測上面也有多種不同的方法，主要包括清除超氧陰離子自由基的能力、抗脂質(zhì)過氧化法、清除羥自由基的能力、清除二苯基苦基苯肼自由基的能力等[8-10]。</p><p>　　從糟醉帶魚中分離、篩選出具抗氧化性的乳酸菌，從而應(yīng)用于制作糟醉帶魚的新工藝中具有現(xiàn)實(shí)的意義。</p><p><b>　　2 材料與設(shè)備</b><

82、;/p><p><b>　　2.1 原材料</b></p><p>　　帶魚：新鮮帶魚，購自寧波水產(chǎn)批發(fā)市場，每尾重200±50 g；</p><p>　　配料：食鹽、白酒、糯米均購自寧波大學(xué)農(nóng)貿(mào)市場，用于自制糟醉帶魚；</p><p>　　糟醉鯧魚（三味可豐）、糟醉馬鮫魚（小島人家）：購于寧波鼓樓農(nóng)產(chǎn)品展銷中心。

83、</p><p><b>　　2.2 試劑 </b></p><p>　　氯化鈉，碳酸鈣，山梨酸鉀，亞油酸，維生素E,硫酸亞鐵，三氯乙酸，硫代巴比妥酸，氫氧化鈉。</p><p><b>　　2.3 儀器與設(shè)備</b></p><p><b>　　2.4 培養(yǎng)基</b><

84、/p><p>　　MRS瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g，K2HPO4 2g，檸檬酸二銨2g，乙酸鈉5g，葡萄糖20g，吐溫801mL，MgSO4 .7H2O 0.58g，MnSO4 4H2O 0.25g，（瓊脂15~20g），蒸餾水1000mL。</p><p>　　液體MRS培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g，檸檬酸鈉2g，葡萄糖20g，K2HPO4 2g，

85、乙酸鈉5g，吐溫801mL，MgSO4 .7H2O 0.58g，MnSO4 4H2O 0.25g，蒸餾水1000mL。</p><p>　　分離純化及保存用培養(yǎng)基：MRS瓊脂培養(yǎng)基加入2% CaCO3及0.2%山梨酸鉀。115℃，滅菌20min備用。</p><p>　　擴(kuò)大培養(yǎng)及活化用培養(yǎng)基：液體MRS培養(yǎng)基120℃，滅菌20min備用。</p><p><

86、b>　　3 試驗(yàn)方法</b></p><p>　　3.1 糟醉帶魚的制作</p><p>　　3.1.1 甜酒釀的制作</p><p>　　3.1.1.1 工藝流程</p><p>　　糯米→去雜、清洗→浸泡→蒸煮→淋水→拌曲→保溫發(fā)酵→甜酒釀</p><p>　　3.1.1.2 操作要點(diǎn)&

87、lt;/p><p>　　去雜與清洗：選擇當(dāng)年生產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)糯米為原料，經(jīng)篩選除雜、碎米后用水淘洗2～3次直至淋出之水不帶白濁為止。</p><p>　　浸泡：將淘洗干凈的糯米置于水中,保持水面高于米面約10cm，根據(jù)溫度控制浸米時(shí)間，一般夏季6～8h，冬季20～24h。因此，在浸泡過程中可勤檢查，用手指能將米粒捻搓成漿粉則說明米已浸透。</p><p>　　蒸煮：將已浸泡過

88、的糯米，放入電磁爐內(nèi)加熱，待蒸汽全部透出飯面，澆熱水于飯面，增加飯粒含水量，蒸煮米飯以松、軟、透、不粘連，內(nèi)心無白心而不糊、不爛為最佳。</p><p>　　淋水：將蒸煮好的米飯拿出，用清水淋，使其溫度下降至35℃左右，飯溫上下一致。淋飯速度要快，淋水量根據(jù)水溫靈活掌握，使飯粒分離，且不糊為好。</p><p>　　拌曲：將適量的酒藥均勻拌入冷卻的飯粒內(nèi)，將飯搭成U型窩。</p>

89、;<p>　　保溫發(fā)酵：置于30℃的電熱恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行。</p><p>　　3.1.2 糟醉帶魚的制作工藝</p><p>　　3.1.2.1 工藝流程</p><p><b>　　甜酒釀</b></p><p><b>　　↓</b></p><p&

90、gt;　　帶魚（前處理）→腌制→干燥→糟醉→成品</p><p>　　3.1..2.2 操作要點(diǎn)</p><p>　　帶魚（前處理）：首先在剖帶魚之前，要洗去覆蓋在魚體表面的一層粘液，以去除大量微生物減少對(duì)后續(xù)加工的污染。接著將帶魚去頭、去尾和去內(nèi)臟，去內(nèi)臟時(shí)要仔細(xì)，不得將魚膽搞破，流出膽汁會(huì)使魚肉發(fā)苦。清洗后瀝干表面水分，切成長約3～4cm的帶魚段。</p><p&g

91、t;　　腌制：采用優(yōu)化后的濕腌工藝條件，在20℃下，20%鹽水中腌制3h，魚：水=1：2的比例。</p><p>　　干燥：腌制魚塊45℃恒溫干燥箱中進(jìn)行脫水，干燥至合適水分。</p><p>　　糟醉：糟制工藝采用加酒量、加鹽量和魚糟比分別為7.1%、4.7%、1：2.2制作糟醉帶魚。</p><p>　　成熟：放30℃恒溫箱中，待其發(fā)酵成熟，大概15天左右。&l

92、t;/p><p>　　3.2 乳酸菌的分離、純化[12]</p><p>　　稱取10g糟醉帶魚樣品，加入0.85%的無菌生理鹽水90ml，混勻配成稀釋濃度分別為10-1 、10-2 、10-3 、10-4的菌懸液。</p><p><b>　　3.2.1 分離</b></p><p>　　在無菌條件下，將制成的不同稀釋度的

93、菌懸液用無菌移液槍分別吸取1ml至培養(yǎng)皿中，后將MRS培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，輕輕混勻，靜置20min，待凝固后倒置于35℃、37℃的恒溫箱中培養(yǎng)48h。</p><p><b>　　3.2.2 純化</b></p><p>　　將培養(yǎng)好的平板取出，觀察菌株生長的情況，計(jì)數(shù)。根據(jù)平板上菌落大小、形態(tài)、干濕、高度、透明度、顏色、邊緣、透明圈等特征辨別出乳酸菌菌株，多次分離劃線

94、，進(jìn)行純培養(yǎng)。待菌株純化后，接種于試管斜面，4℃下保存。</p><p>　　3.3 具抗氧化性的乳酸菌的篩選[13-15]</p><p>　　采用硫代巴比妥酸法，以抗脂質(zhì)過氧化率及與維生素E相比的抑制率為指標(biāo)，篩選出具抗氧化性的乳酸菌。</p><p>　　在0.5mlPBS溶液（濃度為0.02mol/L，pH7.4）中加入1ml亞油酸的乳化液、1%FeSO41

95、ml，再加入0.5ml樣品，37℃水浴反應(yīng)1.5h，混合液中加入0.2ml4%TCA（三氯乙酸）、2ml0.8%TBA（硫代巴比妥酸）。反應(yīng)液100℃水浴反應(yīng)30min，迅速冷卻離心。紗布過濾，收集上清液，在波長532nm處測吸光值，即A532（樣品）。以0.5ml維生素E代替樣品，得到吸光值，即為A532（VE）。</p><p>　　空白對(duì)照組以0.5ml活化培養(yǎng)基代替樣品液，以PBS液加等體積的樣品液離心過

96、濾后調(diào)零，得到吸光值，即為A532（空白）。</p><p><b>　　計(jì)算公式如下：</b></p><p>　　抗脂質(zhì)過氧化率=[1-A532（樣品）/A532（空白）]*100%</p><p>　　與維生素E相比的抑制率=[A532（空白）-A532（樣品）]/[A532（空白）-A532（VE）]*100%</p>&

97、lt;p><b>　　3.4 菌種的鑒定</b></p><p>　　3.4.1 形態(tài)學(xué)觀察</p><p>　　在MRS瓊脂培養(yǎng)基中，在37℃下培養(yǎng)48h，觀察CaCO3 透明圈的產(chǎn)生，初步鑒定。通過肉眼觀察并記錄細(xì)菌的菌落形態(tài)、大小、濕潤度、凹凸、顏色等[16]。</p><p>　　3.4.2 生理生化特征</p>&

98、lt;p>　　主要通過過氧化氫酶試驗(yàn)，糖發(fā)酵試驗(yàn)等方法進(jìn)行[16]。</p><p>　　3.4.3 分子生物學(xué)鑒定[17-21]</p><p><b>　　⑴引物的設(shè)計(jì)</b></p><p>　　用細(xì)菌通用引物擴(kuò)增16SrDNA，引物由上海英俊生物工程公司合成：上游引物5′-AGATTTGATCCTGGCTCAG-3’,下游引物5’

99、-CGGCTACCTTGTTACGAC-3’。</p><p><b>　　⑵樣品前處理</b></p><p>　　配制一定量的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，分裝于試管中，在121℃下濕熱滅菌20min，冷卻后，在無菌條件下接種保存好的待測菌種，在轉(zhuǎn)速125轉(zhuǎn)/min，溫度37℃的搖床中振蕩培養(yǎng)48h。</p><p><b>　?、荄N

100、A的提取</b></p><p>　　①取1.5ml菌液于EP管中，在10,000rmp轉(zhuǎn)速下離心3min，沉淀用STET液洗滌一次，再次離心3min，后將加入400µlTE溶液，混勻；</p><p>　　②加入50mg/ml溶菌酶溶液8µl，在37℃下保溫20min；</p><p>　?、奂尤隦nase10µl，至終濃

101、度25µg/ml，然后加入10%SDS溶液0.05ml，在37℃下保溫10min；</p><p>　?、芗尤氲鞍酌窴10µl，終濃度為50µg/ml，37℃保溫20min；</p><p>　?、菁尤氲润w積苯酚，混勻，10,000rmp轉(zhuǎn)速下離心5min，取上清液于另一試管；重復(fù)該步驟一次，以減少雜質(zhì)；</p><p>　?、揠x心好的

102、上清液中加入等體積的氯仿，混勻，在10,000rmp轉(zhuǎn)速下離心5min，取上清液于另一支試管中；</p><p>　?、呒尤?/10體積醋酸鈉和2倍體積乙醇溶液，在10,000rmp轉(zhuǎn)速下離心10min，去上清液，用70%乙醇洗滌沉淀一次，在室溫下晾干，注意勿使DNA完全干燥；</p><p>　　⑧將干燥好的DNA回溶于40µlTE溶液中。</p><p&g

103、t;<b>　?、?PCR反應(yīng)</b></p><p>　　PCR使用的材料主要有4種：作為模板的DNA分子、DNA引物、DNA聚合酶、4種三磷酸脫氧核苷酸。將4種材料放在合適的緩沖液體系中，每一擴(kuò)增的循環(huán)是首先讓所要擴(kuò)增的DNA雙鏈在高溫下變性(95℃為最適的變性溫度)，雙鏈解開成單鏈；第二步是迅速把緩沖液降到合適的溫度，使DNA復(fù)性；然后把溫度升到70℃左右，這是DNA延伸的最適溫度，1

104、0秒鐘的時(shí)間完成延伸，形成雙鏈，然后重復(fù)此循環(huán)，即變性—復(fù)性—延伸，完成PCR過程。細(xì)菌樣品PCR反應(yīng)體系如下：</p><p>　?、蒔CR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測及鑒定</p><p>　　取PCR產(chǎn)物5µl，加2µl上樣緩沖液，上樣于1%的瓊脂糖凝膠上，同時(shí)在一點(diǎn)樣孔中加5µl DNA Marker作參照。恒壓140V/cm，電泳30min，并在紫外透射儀上觀

105、察，照相。如果PCR產(chǎn)物為一條很亮的亮帶，且擴(kuò)增片段大小與設(shè)計(jì)相符，并無其它雜帶，即可以進(jìn)行PCR產(chǎn)物的回收。</p><p><b>　?、蔖CR產(chǎn)物回收</b></p><p>　?、偎⑾措娪静奂跋鄳?yīng)用具。避免其他DNA的污染。</p><p>　?、?0V電泳半小時(shí)。</p><p>　　③紫外檢測切下所需片斷長度

106、的膠，使它盡可能小。</p><p>　?、軐⑶腥〉沫傊?00mg搗碎按重量比1:3 (DNA片段:溶液RJ solution)加入RJ solution溶液。</p><p>　?、?0℃水浴10min，使瓊脂糖完全融化，每2min顛倒混勻1次。</p><p>　　⑥將融化后的瓊脂糖液移入吸附柱，12,000rmp離心1min，倒掉收集管中的液體，再將吸附柱放

107、入同一個(gè)收集管中。</p><p>　?、呦蛭街屑尤?00µlWash Buffer，靜置1min后，離心15s。倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個(gè)收集管中。如果室溫低于20℃，離心前先靜置1 min。</p><p>　?、?2,000rmp離心1min。</p><p>　?、嵛街湃胍粋€(gè)干凈的1.5m1離心管中，在吸附膜中加入30µ

108、;l水，靜置1 min后，12,000rmp離心1min。將1.5m1離心管(DNA)于﹣20℃保存。</p><p><b>　?、诉B接反應(yīng)</b></p><p>　?、儆眉兓玫腄NA片斷與線狀載體DNA建立以下連接反應(yīng)體系：</p><p>　　pMD-T18 載體 0.5µl</p><p>　

109、　Solution 2.5µl</p><p>　　DNA 4.5µl</p><p>　?、?6℃連接45分鐘。</p><p><b>　　⑻感受態(tài)細(xì)胞的制備</b></p><p>　　①將宿主菌(大腸桿菌DH5α)在瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線，37℃培養(yǎng)20h

110、。</p><p>　?、趶钠桨逯腥〕?個(gè)2mm-3mm大小的單菌落，移至含50m1 LB培養(yǎng)基的500m三角瓶中，37℃300rpm/min強(qiáng)烈振蕩培養(yǎng)3h，使細(xì)胞的溶度達(dá)到5×107個(gè)細(xì)胞/ml，此時(shí)，細(xì)菌的OD600一般在0.2-0.4之間，為對(duì)數(shù)生長前期。</p><p>　?、蹖⑴囵B(yǎng)物于冰上放置1h(至少30min )，然后轉(zhuǎn)移到2個(gè)50ml的離心管中，4,000rpm