振動(dòng)耦合被動(dòng)運(yùn)動(dòng)對(duì)尾吊大鼠骨液流的影響

1、<p>　　單位代碼 10006 </p><p>　　學(xué) 號(hào) 10101010 </p><p>　　1分類號(hào) Q-331 </p><p>　　密 級(jí) </p><p><b>　　畢業(yè)設(shè)計(jì)(論文)&l

2、t;/b></p><p><b>　　振動(dòng)耦合被動(dòng)運(yùn)動(dòng)</b></p><p>　　對(duì)尾吊大鼠骨液流的影響</p><p><b>　　2014年 6月 </b></p><p><b>　　北京航空航天大學(xué)</b></p><p>　　本科生畢

3、業(yè)設(shè)計(jì)（論文）任務(wù)書</p><p>　?、?、畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）題目：</p><p>　　振動(dòng)耦合被動(dòng)運(yùn)動(dòng)對(duì)尾吊大鼠骨液流的影響 </p><p>　　Ⅱ、畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）使用的原始資料（數(shù)據(jù)）及設(shè)計(jì)技術(shù)要求：</p><p>　　原始資料：雌性SD大鼠

4、 </p><p>　　設(shè)計(jì)技術(shù)要求：熟練掌握振動(dòng)耦合被動(dòng)訓(xùn)練裝置，大鼠尾吊技術(shù)，熟練掌握尾靜脈注射方法，會(huì)使用硬組織切片儀進(jìn)行切片操作，可熟練操作激光掃描共聚焦顯微鏡采集圖像，會(huì)使用圖像分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，熟悉大鼠松質(zhì)骨骨密度及骨液流的計(jì)算方法。 </p><p>　　

5、Ⅲ、畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）工作內(nèi)容：</p><p>　?。?）熟練尾吊大鼠振動(dòng)耦合被動(dòng)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練裝置的使用方法。因?yàn)檠芯空駝?dòng)耦合被動(dòng)運(yùn)動(dòng)對(duì)尾吊大鼠骨液流的影響是實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，所以熟練使用尾吊設(shè)備及運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練裝置是實(shí)驗(yàn)進(jìn)行和完成的基礎(chǔ)和根本。</p><p>　　（2）熟練掌握尾靜脈注射方法。尾靜脈注射是后續(xù)進(jìn)行骨組織切片的前提，熟練掌握本課題所用Reactive red分子示蹤劑的注射與制備方法，并通

6、過(guò)尾靜脈注射入大鼠體內(nèi)。 </p><p>　?。?）熟悉掌握切片制作方法。運(yùn)用適用于本課題的骨切片制備方法制備出可用于觀察的標(biāo)本切片。 　　　　　　　　　　　　 </p><p>　?。?）利用共聚焦顯微鏡對(duì)所制得的切片進(jìn)行觀察并得到圖像，并用適當(dāng)?shù)膱D像分析軟件對(duì)骨陷窩個(gè)數(shù)、面積等參數(shù)進(jìn)行測(cè)量、計(jì)算。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

7、匯總分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，探究局部振動(dòng)耦合被動(dòng)運(yùn)動(dòng)對(duì)尾吊大鼠骨液流的影響。 </p><p><b>　?、簟⒅饕獏⒖假Y料：</b></p><p>　　[1] 肖建德主編.實(shí)用骨質(zhì)疏松學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社,2004.8 </p><p>　　[2] 馬永潔,元艷宏,謝力勤等.模擬失重及

8、力負(fù)荷對(duì)大鼠脛骨骨液流的影響[J].航天醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)工程,2003,4:54-57 </p><p>　　[3] Montgomery R J, Sutker B D, Bronk J T, et al. Interstitial fluid flow in cortical bone[J]. Microvascular research, 1988,

9、35(3): 295-307 </p><p>　　[4] Ciani C, Doty S B, Fritton S P. Mapping bone interstitial fluid movement: displacement of ferritin tracer during histological processing[J]. Bone, 20

10、05, 37(3): 379-387 </p><p>　　[5] Kwon R Y, Meays D R, Tang W J, et al. Microfluidic enhancement of intramedullary pressure increases interstitial fluid flow and inhibits bone loss in h

11、indlimb suspended mice[J]. Journal of Bone and Mineral Research, 2010, 25(8): 1798-1807 </p><p>　　[6] Tate M L K, Steck R, Forwood M R, et al. In vivo demonstration of load-i

12、nduced fluid flow in the rat tibia and its potential implications for processes associated with functional adaptation[J]. Journal of Experimental Biology, 2000, 203(18): 2737-2745 </p&g

13、t;<p>　　[7] Ciani C, Doty S B, Fritton S P. An effective histological staining process to visualize bone interstitial fluid space using confocal microscopy[J]. Bone, 2009, 44(5): 1015-1017 </p><p>　　

14、生物與醫(yī)學(xué)工程 學(xué)院 生物工程 專業(yè)類 101011 班</p><p>　　學(xué)生 李文婷 </p><p>　　畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）時(shí)間： 2014年 3月 3 日至 2014 年 6 月 4 日</p><p>　　答辯時(shí)間： 2014 年 6 月 10 日</p><p>　　成 績(jī)： &l

15、t;/p><p>　　指導(dǎo)教師： </p><p>　　兼職教師或答疑教師（并指出所負(fù)責(zé)部分）：</p><p>　　系（教研室）主任（簽字）： </p><p><b>　　本人聲明</b></p><p>　　我聲明，本論文及其研究工作是由本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下獨(dú)立

16、完成的，在完成論文時(shí)所利用的一切資料均已在參考文獻(xiàn)中列出。</p><p><b>　　作者：李文婷</b></p><p><b>　　簽字：</b></p><p>　　時(shí)間：2014年 6 月</p><p>　　振動(dòng)耦合被動(dòng)運(yùn)動(dòng)對(duì)尾吊大鼠骨液流的影響</p><p>

17、;　　學(xué) 生：李文婷 </p><p><b>　　指導(dǎo)教師：孫聯(lián)文 </b></p><p><b>　　摘 要</b></p><p>　　隨著航天載人事業(yè)的蓬勃發(fā)展，宇航員失重性骨質(zhì)疏松現(xiàn)象越來(lái)越受到關(guān)注。目前普遍采取的對(duì)抗措施包括運(yùn)動(dòng)、藥物、企鵝服等，但對(duì)抗效果并不理想。振動(dòng)近年來(lái)被認(rèn)為是對(duì)抗骨質(zhì)疏松最

18、有應(yīng)用前景的方法之一。但是單獨(dú)振動(dòng)的效果并不令人滿意，而與傳統(tǒng)抗阻訓(xùn)練組合的振動(dòng)訓(xùn)練表現(xiàn)出了更大的優(yōu)勢(shì)。此外，骨液流被認(rèn)為對(duì)營(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸和骨細(xì)胞的新陳代謝有重要意義，研究骨液流的變化可能為探究失重性骨丟失的對(duì)抗措施提供依據(jù)。因此，本實(shí)驗(yàn)主要研究振動(dòng)耦合被動(dòng)運(yùn)動(dòng)對(duì)尾吊大鼠骨液流的影響。</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)以雌性SD大鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，利用尾吊模擬失重環(huán)境，在尾吊階段，按照對(duì)照組、尾吊組、尾吊+振動(dòng)組、尾吊+被動(dòng)運(yùn)

19、動(dòng)組、尾吊+振動(dòng)+被動(dòng)運(yùn)動(dòng)組的分組分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過(guò)分析骨陷窩的參數(shù)研究骨液流的變化情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：大鼠尾吊會(huì)減少脛骨骨液流，增加尺骨陷窩個(gè)數(shù)而不影響其總面積，但對(duì)于頂骨并沒(méi)有顯著影響。同時(shí)，局部振動(dòng)耦合被動(dòng)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)大鼠脛骨、尺骨的骨液流都有積極的影響。這可能為研究失重性骨丟失的對(duì)抗措施提供了依據(jù)。</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究振動(dòng)耦合被動(dòng)運(yùn)動(dòng)對(duì)尾吊大鼠骨液流的影響，以期為進(jìn)一步研究振動(dòng)耦合被動(dòng)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)

20、練對(duì)失重性骨丟失的對(duì)抗效果提供理論依據(jù)。</p><p>　　關(guān)鍵詞：尾吊大鼠，振動(dòng)耦合被動(dòng)運(yùn)動(dòng)，骨液流，示蹤劑</p><p>　　Effects of vibration coupling passive movement on bone’s interstitial fluid flow in tail-suspension rat</p><p>　　Aut

21、hor: LI Wen-ting</p><p>　　Tutor: SUN Lian-wen</p><p><b>　　Abstract</b></p><p>　　With the fast development of the shuttle manned career, people are paying more attention

22、on weightlessness osteoporosis in astronauts. Nowadays, common countermeasures cannot effectively relieve the muscle atrophy and bone loss. Vibration is believed to be one of the most prospective methods to solve this pr

23、oblem. However, only vibration itself cannot meet our need. Recently, bone’s interstitial fluid flow (ISF) is believed to be very significant to nutrient supply and waste metabolism of bone t</p><p>　　Ten fe

24、male Sprague-Dawley (SD) rats were divided into five groups: tail-suspension (TS), control (CON), vibration (TSV), passive movement (TSP) and vibration coupling passive movement (TSVP) group. The variation of ISF is anal

25、yzed by the parameters of lacuna. The results show that: tail-suspension could reduce the ISF in tibia, increase the lacuna’s number but not area in ulna and cannot affect the parietal bone. Moreover, vibration coupling

26、passive movement shows a positive influence on the ISF</p><p>　　This study is to study the effects of vibration coupling passive movement on bone’s interstitial fluid flow in tail-suspension for further inve

27、stigations.</p><p>　　Key words：tail-suspension rat, vibration coupling passive movement, ISF, tracer</p><p><b>　　目 錄</b></p><p><b>　　1 緒論1</b></p&

28、gt;<p>　　1.1 課題背景及目的1</p><p>　　1.2 國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀4</p><p>　　1.3 論文構(gòu)成及研究?jī)?nèi)容5</p><p>　　1.3.1 大鼠尾吊5</p><p>　　1.3.2 脛骨micro-CT掃描6</p><p>　　1.3.3 尾靜脈注

29、射7</p><p>　　1.3.4 切片制備7</p><p>　　1.3.5 采集圖像與處理獲取參數(shù)8</p><p>　　1.4 課題研究方法10</p><p>　　2 實(shí)驗(yàn)方案12</p><p>　　2.1 實(shí)驗(yàn)材料12</p><p>　　2.1.1 實(shí)驗(yàn)材

30、料12</p><p>　　2.1.2 實(shí)驗(yàn)器材12</p><p>　　2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器12</p><p>　　2.1.4 主要試劑12</p><p>　　2.1.5 溶液配置13</p><p>　　2.2 大鼠尾吊及局部振動(dòng)耦合被動(dòng)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)13</p><p&

31、gt;　　2.2.1 環(huán)境控制13</p><p>　　2.2.2 局部振動(dòng)耦合被動(dòng)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練裝置的設(shè)計(jì)14</p><p>　　2.2.3 尾吊步驟15</p><p>　　2.2.4 TSV組、TSP組、TSVP組以及CON組大鼠的處理15</p><p>　　2.2.5 實(shí)驗(yàn)期間的注意事項(xiàng)16</p>&

32、lt;p>　　2.3 脛骨micro-CT掃描與3D重建16</p><p>　　2.4 尾靜脈注射Reactive red溶液16</p><p>　　2.5 大鼠脛骨、尺骨以及頂骨的解剖分離18</p><p>　　2.6 切片制作18</p><p>　　2.7 激光共聚焦顯微鏡圖像采集19</p>

33、<p>　　2.7 參數(shù)測(cè)量21</p><p>　　3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論分析22</p><p>　　3.1 脛骨22</p><p>　　3.1.1 micro-CT掃描結(jié)果22</p><p>　　3.1.2 共聚焦圖像對(duì)比骨陷窩個(gè)數(shù)22</p><p>　　3.1.3 骨陷窩個(gè)

34、數(shù)23</p><p>　　3.1.4 骨陷窩面積24</p><p>　　3.2 尺骨25</p><p>　　3.2.1 共聚焦圖像對(duì)比骨陷窩個(gè)數(shù)25</p><p>　　3.2.2 骨陷窩個(gè)數(shù)25</p><p>　　3.2.3 骨陷窩面積26</p><p>　　3

35、.3 頂骨27</p><p>　　3.3.1 共聚焦圖像對(duì)比骨陷窩個(gè)數(shù)27</p><p>　　3.3.2 骨陷窩個(gè)數(shù)27</p><p>　　3.3.3 骨陷窩面積28</p><p>　　3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的討論分析29</p><p><b>　　結(jié)論31</b><

36、;/p><p><b>　　致謝32</b></p><p><b>　　參考文獻(xiàn)33</b></p><p><b>　　1 緒論</b></p><p>　　1.1 課題背景及目的</p><p>　　骨質(zhì)疏松癥是婦女和老年人面臨的主要問(wèn)題之一。

37、骨折是骨質(zhì)疏松癥的病癥之一，然而骨質(zhì)疏松癥更多地表現(xiàn)為骨量減少導(dǎo)致的骨折風(fēng)險(xiǎn)增大[1]。在世界范圍內(nèi)，骨質(zhì)疏松問(wèn)題困擾著上億人的健康生活，無(wú)數(shù)患者在痛苦中等待有效的治愈方法，如何研究出一種切實(shí)有效又簡(jiǎn)便易行的治療方法已成為當(dāng)務(wù)之急。并且，隨著人類科技水平的迅猛發(fā)展以及地球資源的大量開發(fā)，如何搶占太空資源，將國(guó)家建成太空大國(guó)、太空強(qiáng)國(guó)已成為不可回避的大趨勢(shì)。我國(guó)載人航天事業(yè)已進(jìn)入空間站計(jì)劃階段，計(jì)劃將在2020年左右建立自己的空間站；在2

38、030年前后實(shí)現(xiàn)載人登月，并建立月球基地；在2050年前后，載人飛行將從月球基地飛向更遠(yuǎn)的行星，并具備載人登火星的能力。因此，航天員失重性骨質(zhì)疏松現(xiàn)象也越來(lái)越受到關(guān)注。在太空中的微重力下，航天員會(huì)出現(xiàn)心血管系統(tǒng)失調(diào)、骨質(zhì)疏松和鈣磷代謝失衡、肌肉功能下降和肌萎縮等一系列適應(yīng)性生理變化[2]。在太空環(huán)境中，由于微重力作用導(dǎo)致的骨負(fù)重減少、骨鈣流失，骨量丟失的速度將達(dá)到地球上的10倍，承重骨的骨礦物質(zhì)密度甚至每個(gè)月將減少1.0%-2.0%[3

39、]。為此，各國(guó)都采取了不同的對(duì)抗措施來(lái)解決微重力導(dǎo)致的骨丟失問(wèn)題。但是，無(wú)論</p><p>　　針對(duì)“為什么現(xiàn)有運(yùn)動(dòng)不能有效對(duì)抗空間失重性骨質(zhì)疏松？”這一問(wèn)題，我們課題組曾大膽假設(shè)：運(yùn)動(dòng)類型的實(shí)質(zhì)性轉(zhuǎn)變（主動(dòng)運(yùn)動(dòng)在某種程度上轉(zhuǎn)變?yōu)楸粍?dòng)運(yùn)動(dòng)）可能是造成目前空間運(yùn)動(dòng)鍛煉不能有效對(duì)抗失重性骨質(zhì)疏松的原因之一。那么，在空間采取什么措施才能提高被動(dòng)運(yùn)動(dòng)對(duì)抗骨丟失的效果呢？</p><p>　　振動(dòng)

40、近年來(lái)被認(rèn)為是對(duì)抗骨質(zhì)疏松最有應(yīng)用前景的方法之一。振動(dòng)應(yīng)用于對(duì)抗骨質(zhì)疏松是將振動(dòng)形式的機(jī)械刺激，作用于人體骨骼骨細(xì)胞增長(zhǎng)區(qū)，從而使骨細(xì)胞生長(zhǎng)，骨量增加，對(duì)抗松質(zhì)骨流失。全身振動(dòng)可以通過(guò)傳遞機(jī)械加速度到四肢骨與中軸骨而誘導(dǎo)骨量增加。通過(guò)目前已得出的研究進(jìn)展，我們發(fā)現(xiàn)短期振動(dòng)訓(xùn)練已作為增強(qiáng)神經(jīng)肌肉性能的一種訓(xùn)練方法被使用。相關(guān)文獻(xiàn)已經(jīng)證實(shí)全身振動(dòng)可以增強(qiáng)女性膝屈肌的靈活性和力量，并提高“功能性”腿筋,四頭肌肌肉比率[4] 。與此同時(shí)，在針對(duì)

41、優(yōu)秀體操運(yùn)動(dòng)員的振動(dòng)實(shí)驗(yàn)中，振動(dòng)組也表現(xiàn)出了更好的平衡感、靈活度，且下肢相比也更有爆發(fā)力[5] 。因此，我們有理由認(rèn)為利用振動(dòng)來(lái)對(duì)抗失重性骨質(zhì)疏松是非常有前景的。</p><p>　　然而，有研究發(fā)現(xiàn)全身振動(dòng)可引起人體的不適以及損害外周血管，且全身振動(dòng)的效果依賴于身體姿勢(shì)[6, 7]。加之，由空間飛行（宇航員）及脊髓損傷（常人）導(dǎo)致的骨丟失及肌肉萎縮等主要發(fā)生在下肢等承重部位。因此，采用針對(duì)下肢的局部振動(dòng)應(yīng)比全身

42、振動(dòng)更適合于這些人群。此外，在絕經(jīng)后婦女的振動(dòng)與抗阻運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)中，振動(dòng)耦合抗阻運(yùn)動(dòng)組表現(xiàn)出了更高的肌肉強(qiáng)度，即是說(shuō)振動(dòng)不僅放大了抗阻運(yùn)動(dòng)的效果，抗阻運(yùn)動(dòng)也促進(jìn)了振動(dòng)的訓(xùn)練效果[8]。關(guān)于這方面，從相關(guān)研究中我們發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)的振動(dòng)不能增加最大等張收縮和力學(xué)性能，而與傳統(tǒng)抗阻訓(xùn)練組合的振動(dòng)訓(xùn)練表現(xiàn)出了最大等張收縮和力學(xué)性能的增加[9]。在振動(dòng)平臺(tái)上的競(jìng)技類深蹲實(shí)驗(yàn)中，我們也發(fā)現(xiàn)，振動(dòng)平臺(tái)上的深蹲組與傳統(tǒng)深蹲訓(xùn)練組相比，在最大肌力和爆發(fā)力方面表現(xiàn)

43、出了優(yōu)勢(shì)[10]。因此，我們有理由認(rèn)為單純的振動(dòng)訓(xùn)練不能完成預(yù)期的對(duì)抗效果，而將之與其他形式的訓(xùn)練相結(jié)合可能能表現(xiàn)出更令人滿意且更有優(yōu)勢(shì)的效果。另外，由于目前空間宇航員運(yùn)動(dòng)類型的轉(zhuǎn)換、下肢廢用及骨關(guān)節(jié)炎等病人不方便進(jìn)行主動(dòng)運(yùn)動(dòng)，采用局部振動(dòng)耦合被動(dòng)運(yùn)動(dòng)的方式來(lái)對(duì)抗骨丟失可能更適應(yīng)于此類人群，而且有關(guān)于局部振動(dòng)及局部振動(dòng)耦合被動(dòng)</p><p>　　綜上所述，為了節(jié)約宇航員的運(yùn)動(dòng)時(shí)間，最大程度的提高空間的運(yùn)動(dòng)效果，

44、我們提出了局部振動(dòng)耦合被動(dòng)運(yùn)動(dòng)的訓(xùn)練方式，希望可以在對(duì)抗微重力造成的骨丟失方面產(chǎn)生“1+1”大于“2”的效果?，F(xiàn)在，各研究機(jī)構(gòu)普遍采用尾吊大鼠來(lái)模擬宇航員在太空微重力下的骨丟失狀況。針對(duì)這一情況，通過(guò)研究振動(dòng)耦合被動(dòng)運(yùn)動(dòng)對(duì)尾吊大鼠的影響來(lái)試圖闡明骨丟失的機(jī)制以及振動(dòng)耦合被動(dòng)運(yùn)動(dòng)對(duì)失重性骨丟失的對(duì)抗效果是有一定可行性的。</p><p>　　與此同時(shí)，我們也注意到，在微重力條件下骨組織產(chǎn)生的變化中，不同部位的骨骼受

45、到了不同程度的影響。依據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)，飛行4.5～6 月的“和平”號(hào)航天員頭部出現(xiàn)骨密度增高，而骨盆、下肢骨出現(xiàn)密度下降[11]。并且，也有實(shí)驗(yàn)證明尾吊模擬失重的大鼠也出現(xiàn)了顱骨和下頜骨骨量增加，后肢骨骨丟失的現(xiàn)象。在微重力條件下航天員出現(xiàn)體液頭向分布，不同部位骨丟失狀況不同的現(xiàn)象[12]。這一現(xiàn)象用傳統(tǒng)的Wolff 定律無(wú)法解釋。Dillaman 提出的液流理論能較好解釋上述現(xiàn)象[13]。液流理論認(rèn)為骨骼應(yīng)力適應(yīng)性的源動(dòng)力是應(yīng)變梯度介導(dǎo)間

46、質(zhì)液體沿小管和骨細(xì)胞突起的流動(dòng)。液流主要對(duì)骨進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)的供給與廢物的排除，此外骨是一種孔隙結(jié)構(gòu)，以往研究發(fā)現(xiàn)外力引起的骨組織形變，其間隙液流流動(dòng)阻力及剪切力，會(huì)間接作用于骨組織細(xì)胞使其發(fā)生適應(yīng)性改變。受流體剪切力刺激后的骨細(xì)胞通過(guò)與成骨細(xì)胞的間隙連接或釋放信號(hào)分子，能增強(qiáng)成骨細(xì)胞的活性。大鼠后肢懸吊時(shí)，體液頭向分布，頭部的骨間隙中液體增加，經(jīng)過(guò)后肢骨的液流減少。對(duì)尾吊小鼠骨液流變化的研究可能能為骨丟失的機(jī)制及對(duì)抗措施提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。<

47、/p><p>　　骨是一種持續(xù)調(diào)節(jié)自身結(jié)構(gòu)來(lái)適應(yīng)其力學(xué)環(huán)境的生物學(xué)系統(tǒng)。力學(xué)信號(hào)對(duì)于其適應(yīng)過(guò)程是很重要的。有三種類型的骨細(xì)胞：成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞。普遍認(rèn)為骨細(xì)胞是可以感受力學(xué)載荷的細(xì)胞。這些細(xì)胞被骨基質(zhì)包埋且通過(guò)由微管的小骨管定位的細(xì)長(zhǎng)細(xì)胞過(guò)程相互連通。</p><p>　　雖然骨細(xì)胞被認(rèn)為是力學(xué)信號(hào)的感受器，但是力學(xué)載荷是如何從骨組織轉(zhuǎn)換到這些細(xì)胞的仍然是未知的。一些研究認(rèn)為骨細(xì)胞感

48、知了整個(gè)骨組織的張力。然而，這一觀點(diǎn)導(dǎo)致了一個(gè)基本的悖論：活體內(nèi)作用于整個(gè)骨的張力（如組織級(jí)張力）是遠(yuǎn)小于（0.04%-0.3%）細(xì)胞培養(yǎng)中激活骨細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的張力（1-10%）[14]。</p><p>　　尤等人提出了一個(gè)新的張力放大過(guò)程和模型，以此來(lái)解釋力學(xué)載荷誘導(dǎo)的陷窩-微管系統(tǒng)中的液體流動(dòng)，在日常身體活動(dòng)下，可以產(chǎn)生至少比整個(gè)骨組織變形放大一個(gè)數(shù)量級(jí)的骨細(xì)胞過(guò)程變形。這個(gè)新的模型為矛盾提供了一個(gè)可信的解

49、釋，這個(gè)矛盾即激活骨細(xì)胞所需的更大的張力不能直接由骨基質(zhì)變形提供，否則將導(dǎo)致骨折的事實(shí)。這個(gè)模型假定三個(gè)基本成分的存在：1）填充了整個(gè)骨細(xì)胞胞體和細(xì)胞過(guò)程的細(xì)胞外周空間的骨有機(jī)質(zhì)，2）通過(guò)微管錨定和集中骨細(xì)胞過(guò)程的橫向成分，3）在細(xì)胞過(guò)程中對(duì)抗環(huán)周張力和彎曲變形的晶體結(jié)構(gòu)。當(dāng)骨負(fù)重時(shí)，變形誘導(dǎo)的壓力梯度會(huì)導(dǎo)致陷窩-微管系統(tǒng)的細(xì)胞外周空間中的液體流動(dòng)（骨液流）。胞外基質(zhì)上的液流傳送到骨細(xì)胞過(guò)程周圍的細(xì)胞外周空間，由此產(chǎn)生變形。因此產(chǎn)生的張

50、力由跨膜蛋白及鏈接分子傳至細(xì)胞過(guò)程及細(xì)胞骨架，并產(chǎn)生向外的環(huán)狀張力。骨細(xì)胞過(guò)程的肌動(dòng)蛋白束主要對(duì)抗此環(huán)狀張力。這兩個(gè)力的平衡導(dǎo)致了細(xì)胞骨架的形變并產(chǎn)生了至少比組織張力大一個(gè)數(shù)量級(jí)的力[15]。骨可能不是對(duì)組織形變敏感，而是對(duì)骨液流導(dǎo)致的壓力產(chǎn)生電勢(shì)（SGP）敏感。由于骨細(xì)胞對(duì)電場(chǎng)敏感，所以其可能直接回應(yīng)SGP。并且，流體剪切力表現(xiàn)出對(duì)骨細(xì)胞的直接刺激，</p><p>　　1.2 國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀</p&g

51、t;<p>　　骨細(xì)胞間質(zhì)液流動(dòng)（骨液流）被認(rèn)為對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸和來(lái)自骨細(xì)胞的新陳代謝廢物的運(yùn)輸有幫助[17]。為了更好地理解骨中的細(xì)胞間質(zhì)液運(yùn)動(dòng)，相關(guān)方法使用像普施安紅（300~400Da，直徑＜1nm），活性紅（1470Da，直徑~1nm），微過(guò)氧化物酶（1860Da，直徑~2nm），辣根過(guò)氧化物酶（40kDa，直徑~6nm），鐵蛋白（440kDa，直徑~12nm）等標(biāo)記或示蹤劑，并且不同大小的葡聚糖（范圍從300Da到

52、2000kDa，直徑~1nm到60nm）被用來(lái)示意不同大小的分子是如何穿過(guò)骨中不同的多孔性[18,19,20,21,22,23,24,25]。</p><p>　　皮質(zhì)骨的結(jié)構(gòu)有3個(gè)級(jí)別的孔隙度：血管孔隙度，陷窩-微管孔隙度，以及礦化基質(zhì)的膠原-磷灰石孔隙度。動(dòng)物的血管孔隙度沒(méi)有二級(jí)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，比如大鼠和小鼠，包括初級(jí)管和橫向管；這個(gè)孔隙度是三個(gè)骨孔隙度中最大的（20μm級(jí)[26]）。陷窩-微管孔隙度是由陷窩和微管

53、中的骨細(xì)胞周圍的空間形成的（100nm級(jí)[14]）。在微管中，細(xì)胞外周的纖維基質(zhì)的作用被認(rèn)為是維持細(xì)胞進(jìn)程在相應(yīng)的位置，將它們與微管壁相連接[27]，并且使它們免于折疊[14]。纖維基質(zhì)的間隔被認(rèn)為大概為7~8nm，與內(nèi)皮細(xì)胞上的表面多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物相似，并且纖維基質(zhì)被認(rèn)為其工作機(jī)制類似濾網(wǎng)，只允許小于孔直徑的分子通過(guò)。最后，最小的骨孔隙度是與在膠原纖維和礦物磷灰石微晶之間的空間相連的膠原-磷灰石孔隙度?？紤]到陷窩-微管系統(tǒng)的孔隙度，

54、本實(shí)驗(yàn)使用直徑為1nm的Reactive red示蹤劑進(jìn)行研究，由于其直徑小，可能進(jìn)入到骨組織更小的空間內(nèi)，因此可以較好地了解骨細(xì)胞在體內(nèi)的骨代謝情況以及骨內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化情況。</p><p>　　在骨質(zhì)疏松的對(duì)抗方面，目前已有的研究措施有藥物治療[28, 29]，以期利用相關(guān)藥物作用達(dá)到提高激素水平和鈣攝取量的目的；物理治療、運(yùn)動(dòng)以及振動(dòng)等，用以對(duì)肌骨系統(tǒng)提供力學(xué)刺激，以期減少太空微重力環(huán)境對(duì)骨的負(fù)性影響。其中

55、已應(yīng)用在太空飛行中只有運(yùn)動(dòng)和振動(dòng)。運(yùn)動(dòng)可以對(duì)骨產(chǎn)生應(yīng)力，在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中地面或運(yùn)動(dòng)器械等對(duì)骨產(chǎn)生的反作用力，表現(xiàn)在運(yùn)動(dòng)中可以為抗阻運(yùn)動(dòng)或沖擊性運(yùn)動(dòng)，另一種是運(yùn)動(dòng)中肌肉收縮對(duì)骨骼產(chǎn)生的拉力、壓力以及剪切力等。其中運(yùn)動(dòng)主要又分為主動(dòng)運(yùn)動(dòng)和被動(dòng)運(yùn)動(dòng)。除了運(yùn)動(dòng)對(duì)抗骨質(zhì)疏松外，國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)振動(dòng)能夠促進(jìn)新骨形成，對(duì)抗松質(zhì)骨流失。振動(dòng)應(yīng)用于對(duì)抗骨質(zhì)疏松是將振動(dòng)形式的機(jī)械刺激，作用于人體骨骼骨細(xì)胞增長(zhǎng)區(qū)，從而使骨細(xì)胞生長(zhǎng)，骨量增加[30]，對(duì)抗松質(zhì)骨流失

56、。前蘇聯(lián)就曾對(duì)太空飛行長(zhǎng)達(dá)5個(gè)月之久的航天員實(shí)施全身振動(dòng)訓(xùn)練，發(fā)現(xiàn)其骨密度得到較好的保持[31]。因此研究局部振動(dòng)耦合被動(dòng)運(yùn)動(dòng)對(duì)抗失重性骨丟失的效果是十分有前景的。</p><p>　　1.3 論文構(gòu)成及研究?jī)?nèi)容</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)主要包括大鼠尾吊、脛骨Micro-CT掃描、大鼠尾靜脈注射、顱骨、脛骨及尺骨的解剖制備、硬組織切片制備、圖像采集和圖像參數(shù)的處理分析。</p&

57、gt;<p>　　1.3.1 大鼠尾吊</p><p>　　模型的選取直接關(guān)系到模擬空間微重力的相關(guān)實(shí)驗(yàn)的效果，因此，模擬空間微重力的模型至少包括以下幾點(diǎn)：1）整個(gè)系統(tǒng)不應(yīng)使動(dòng)物處于長(zhǎng)期緊張狀態(tài)；2）模型的無(wú)負(fù)載狀態(tài)必須不麻痹或限制動(dòng)物的正常動(dòng)作，并確保動(dòng)物具有重新加負(fù)載和從無(wú)負(fù)載狀態(tài)中恢復(fù)的能力；3）模型的肌萎縮、骨丟失等狀況應(yīng)當(dāng)與空間飛行中發(fā)生的狀況相似；4）模型需要提供與空間飛行狀態(tài)相似的體

58、液頭向分布狀態(tài)；5）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)無(wú)負(fù)載狀態(tài)的生理反應(yīng)應(yīng)當(dāng)與空間飛行相似 [32] 。只有滿足了以上條件的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ筒拍芎侠淼啬M空間失重性骨丟失的影響并研究不同對(duì)抗措施的對(duì)抗效果。</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)選用的尾吊大鼠模擬空間微重力模型可以基本滿足以上條件。首先，由于大鼠正常情況下四肢都是負(fù)重的，尾吊大鼠模擬空間微重力模型可以保證大鼠的前肢方便地活動(dòng)、取食、理毛，因此可以最低限度地減輕實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的緊張，保持實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

59、的健康。其次，尾吊大鼠模型產(chǎn)生的頭向姿勢(shì)可以產(chǎn)生一個(gè)向頭部的液體轉(zhuǎn)移，就如同人體頭部向下臥床實(shí)驗(yàn)和空間飛行中一樣，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中都可以維持[33]。此外，研究表明下肢去負(fù)重的大鼠模型產(chǎn)生的骨的變化與空間飛行相似，模型動(dòng)物與往返飛行的太空飛行動(dòng)物的體重都與對(duì)照組相似[34]。最后，不同于早期的實(shí)驗(yàn)研究采用全身束縛[35]或?qū)Υ笫蟊巢窟M(jìn)行外科手術(shù)操作[36,37]來(lái)達(dá)到頭部向下的姿勢(shì)，雖然這些操作都可以達(dá)到后肢無(wú)負(fù)重的目的，但是這樣會(huì)使大

60、鼠在無(wú)負(fù)重狀態(tài)中產(chǎn)生壓力而影響實(shí)驗(yàn)效果[38]。而本實(shí)驗(yàn)采用的大鼠尾吊模型在經(jīng)過(guò)對(duì)其尾部的清潔處理、懸吊后可以基本滿足以上條件，是較為合適的模擬空間微重力的動(dòng)物模型。</p><p>　　尾吊模型在利用大鼠和小鼠的研究類空間飛行變化中被廣泛使用。其中，大鼠尾吊無(wú)負(fù)重模型主要應(yīng)用于研究失重引起的肌骨、心血管系統(tǒng)以及生理代謝的變化[33]。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇SD（Sprague-Dawley）大鼠作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。根?jù)相關(guān)

61、研究，我們發(fā)現(xiàn)成年雄性大鼠的骨垢端在30個(gè)月時(shí)仍沒(méi)有完全停止生長(zhǎng)，這種不穩(wěn)定的狀態(tài)極有可能會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響，且多數(shù)文獻(xiàn)提出雄性大鼠作為模擬失重性骨丟失的模型并不合適[39]，因此本實(shí)驗(yàn)選擇雌性SD大鼠建立模型。</p><p>　　為了最大程度減少大鼠的緊張并維持大鼠的身體健康，以下兩個(gè)環(huán)境和生理參數(shù)是很重要的。其一是住所，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的住所應(yīng)該位于獨(dú)立的房間中，且在實(shí)驗(yàn)期間只有與實(shí)驗(yàn)相關(guān)的人員可以進(jìn)入飼養(yǎng)環(huán)境中

62、。其二是室溫，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，室溫在24.5到25.5℃之間是比較合適的[40]。與此同時(shí)，在生理方面也有兩點(diǎn)值得考慮。其一是體重，下肢去負(fù)重組與對(duì)照組的體重差異可以影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如果大鼠在24小時(shí)內(nèi)體重減少10%，那么其可能存在健康問(wèn)題或生活環(huán)境的問(wèn)題。如果2天后體重不能恢復(fù)的話，應(yīng)該將此樣本淘汰。其二是年齡，年幼大鼠與成年大鼠相比更容易適應(yīng)尾吊無(wú)負(fù)重狀態(tài)?？焖偕L(zhǎng)大鼠（<200g）不應(yīng)該減少體重，即使與對(duì)照組相比其體重增長(zhǎng)的較慢

63、。成年大鼠（>200g）可能減少體重或趨于穩(wěn)定[40]。</p><p>　　1.3.2 脛骨micro-CT掃描</p><p>　　骨密度BMD尤其是人體主要承重骨的骨密度與其極限應(yīng)力、極限能量、彈性模量呈線性正相關(guān)，通過(guò)測(cè)骨密度可初步預(yù)測(cè)其力學(xué)性能，因此被世界衛(wèi)生組織用來(lái)作為骨質(zhì)疏松的診斷標(biāo)準(zhǔn)。目前可以測(cè)量骨密度的設(shè)備有單能X線骨密度儀、雙能X線骨密度儀以及CT。</p

64、><p>　　DXA測(cè)量的骨密度BMD（單位：g/cm2）是面積密度，相對(duì)骨礦含量BMC（單位：g）數(shù)據(jù)更加穩(wěn)定同時(shí)可以反應(yīng)BMC的變化，所以一般最常用的指標(biāo)就是BMD。與DXA測(cè)得的平面骨密度不同，Micro-CT由于X線管的旋轉(zhuǎn)和三維模型重建，測(cè)得骨密度為體密度也就是vBMD（Volumetric BMD），在保證掃描參數(shù)及感興趣區(qū)域相同的情況下，可以測(cè)得更精準(zhǔn)的骨礦含量及密度。且Micro-CT對(duì)骨礦含量測(cè)量更

65、敏感，因此對(duì)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)而言，Micro-CT更加適合。因此，此次實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)組選擇micro-CT作為實(shí)驗(yàn)設(shè)備檢測(cè)脛骨骨密度。</p><p>　　1.3.3 尾靜脈注射</p><p>　　大鼠尾靜脈注射技術(shù)是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中常用的藥物干預(yù)的方法之一，在本實(shí)驗(yàn)中，熟練利用大鼠尾靜脈注射技術(shù)在大鼠尾部注射Reactive red分子示蹤劑是確保實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行的必要條件。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，大鼠尾靜脈有4

66、根，分別位于尾部左右兩側(cè)和背腹部。由于左右兩側(cè)與另兩根相比較淺且容易暴露，因此本實(shí)驗(yàn)選擇左右兩側(cè)靜脈進(jìn)行穿刺注射。大鼠尾部帶有的環(huán)狀表皮鱗可能會(huì)干擾到實(shí)驗(yàn)操作，所以在進(jìn)針前應(yīng)使用溫水（50℃-60℃）浸泡大鼠尾部，將尾部擦干后用醫(yī)用酒精擦洗，此時(shí)表面角質(zhì)層脫落且血管得到充分?jǐn)U張，更易進(jìn)針[41]。注射時(shí)一般選擇距尾尖1/4或1/3處，因?yàn)榇颂幤つw較薄且血管清晰，進(jìn)針更容易。注射時(shí)將針頭與靜脈成15°角進(jìn)針[42]，進(jìn)針后針頭立

67、即與血管平行，輕輕回抽時(shí)有明顯回血，既可以開始推注了。正常情況下推注時(shí)無(wú)明顯阻力且血管不會(huì)鼓起，如遇沒(méi)有回血的情況，應(yīng)立刻拔出針頭重新穿刺，避免強(qiáng)行推注導(dǎo)致大鼠尾部皮下水腫。由于本實(shí)驗(yàn)使用的是有顏色的分子示蹤劑，則應(yīng)該更加注意此操作。</p><p>　　1.3.4 切片制備</p><p>　　骨組織因?yàn)橛泄躯}沉積的緣故，是較為堅(jiān)硬的結(jié)締組織。制作骨切片的傳統(tǒng)方法流程包括脫鈣、脫水透明

68、、石蠟包埋以及切片，最后染色觀察。但是這一系列組織學(xué)處理過(guò)程可能會(huì)導(dǎo)致骨內(nèi)酶活性下降、骨組織結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，并影響許多敏感指標(biāo)的檢測(cè)甚至?xí)?yán)重影響后續(xù)觀察結(jié)果[43]。因此傳統(tǒng)的切片方法并不適合本實(shí)驗(yàn)觀察骨液流使用，因此，本實(shí)驗(yàn)使用硬組織切片技術(shù)。硬組織切片技術(shù)具有不破壞骨組織結(jié)構(gòu)和成分，在觀測(cè)過(guò)程中保證骨內(nèi)結(jié)構(gòu)及各成分不失真等優(yōu)點(diǎn)[44，45]。所以，硬組織切片技術(shù)對(duì)研究骨組織成分、骨形成和骨內(nèi)代謝有十分明顯的優(yōu)勢(shì)。</p>

69、<p>　　骨切片又可以分為脫鈣切片、不脫鈣切片和骨膜片。但是，這些方法都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，硬骨磨片不易影響骨內(nèi)酶水平及代謝情況，但磨片易破裂而不完整[46]；脫鈣切片需將標(biāo)記染色的骨標(biāo)本用脫鈣劑處理后再用冷凍劑或石蠟包埋，但這一系列復(fù)雜的組織學(xué)處理過(guò)程易使切片變形、失真，且石蠟包埋和冷凍處理的過(guò)程會(huì)造成本實(shí)驗(yàn)示蹤分子的淬滅，因此硬骨磨片和脫鈣切片都不適合于本實(shí)驗(yàn)對(duì)于骨液流的研究。不脫鈣切片可以完整地保存骨組織的礦化結(jié)構(gòu)，可

70、以測(cè)量包括骨小梁面積百分比（Tb.At）、數(shù)目（Tb.N）、間隙（Tb.Sp）、以及骨小梁周長(zhǎng)（Tb.Pm）[47]等參數(shù)，更利于本實(shí)驗(yàn)對(duì)于骨液流變化情況的觀察。</p><p>　　綜上所述，本實(shí)驗(yàn)采用不脫鈣不包埋硬組織切片技術(shù)進(jìn)行骨切片的制備，但是這種切片方法的缺點(diǎn)是由于骨組織較硬、切片方法不易掌握，因此，本實(shí)驗(yàn)制備的脛骨、尺骨切片厚度只能達(dá)到100µm，由于頂骨較大且屬于扁骨、大鼠顱骨不規(guī)則等原因

71、，頂骨切片的厚度只能達(dá)到150µm。</p><p>　　此外，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行封片處理使用的封片劑是中性樹膠。中性樹膠具有透明度高、ph呈中性而不宜對(duì)玻璃造成腐蝕、其使用的溶劑二甲苯有殺霉菌作用可使切片可以長(zhǎng)期保存等優(yōu)點(diǎn)。中性樹膠已廣泛作為生物切片的封藏試劑使用，操作簡(jiǎn)單且價(jià)格便宜，因此本實(shí)驗(yàn)使用二甲苯輔助中性樹膠作為封片處理的封片劑。</p><p>　　1.3.5 采集圖像與處

72、理獲取參數(shù)</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)選用激光掃描共聚焦顯微鏡（Confocal laser scanning microscope，CLSM）觀察經(jīng)Reactive red染色后的脛骨、尺骨、頂骨切片，在調(diào)整好合適的位置和焦距后選擇所需區(qū)域拍照保存。</p><p>　　自二十世紀(jì)八十年代激光掃描共聚焦顯微鏡面世以來(lái)，由于其具有成像清晰、精確、客觀等優(yōu)勢(shì)，這種功能強(qiáng)大、使用便捷的顯微鏡已

73、經(jīng)越來(lái)越廣泛地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)各方各面的研究當(dāng)中。首先必須要強(qiáng)調(diào)的是，評(píng)價(jià)一臺(tái)顯微鏡性能優(yōu)劣的標(biāo)準(zhǔn)并不應(yīng)該只是其放大倍數(shù)，真正影響其成像清晰度和成像質(zhì)量的因素應(yīng)該是分辨力。分辨力一般用顯微鏡所能分辨清晰的最近的相鄰兩點(diǎn)之間的距離來(lái)衡量。顯微鏡的放大倍數(shù)即是正常人眼分辨力與顯微鏡分辨力的比值。但是，在實(shí)際應(yīng)用中，普通光學(xué)顯微鏡的分辨力會(huì)受到物理因素以及透鏡質(zhì)量的影響，包括球差和色差的影響。球差是指透鏡不能把近軸光線和遠(yuǎn)軸光線在光軸上共聚

74、焦，導(dǎo)致點(diǎn)光線通過(guò)透鏡后無(wú)法匯聚而形成光斑，最后導(dǎo)致圖像模糊不清的現(xiàn)象。而色差是指顯微鏡針對(duì)不同顏色的光線折射率不同引起的不同顏色的光無(wú)法聚焦在一點(diǎn)而使圖像模糊的現(xiàn)象。與普通光學(xué)顯微鏡相比，激光掃描共聚焦顯微鏡具有以下特點(diǎn)[48]：1）用激光作光源。采用單色性更好的激光從根本上解決色差問(wèn)題；2）利用共聚焦技術(shù)。利用物鏡焦平面前放置的中有小孔的擋板擋住雜散光，從根本上解決球差的問(wèn)題，并輔助解決色差的問(wèn)題；3）采用點(diǎn)掃描技術(shù)。不同于傳統(tǒng)的光

75、學(xué)</p><p>　　被譽(yù)為萬(wàn)能顯微鏡的激光掃描共聚焦顯微鏡在功能上幾乎可以完全涵蓋日常實(shí)驗(yàn)中使用的大多數(shù)光學(xué)顯微鏡。它兼具倒置光學(xué)顯微鏡、紫外線顯微鏡、熒光顯微鏡、暗視野顯微鏡、相差顯微鏡(PH)、微分干涉差顯微鏡(DIC)等常用顯微鏡的種種功能，其產(chǎn)生的圖像的精細(xì)程度又可以媲美甚至大大超過(guò)任何一種光學(xué)顯微鏡。因此，激光掃描共聚焦顯微鏡被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)的研究中。一臺(tái)裝置完備的激光掃描共聚焦顯微鏡應(yīng)包括以下

76、四部分：1）熒光顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)：熒光顯微鏡作為激光掃描共聚焦顯微鏡的一個(gè)重要的組成部分，其主要是用于預(yù)覽樣品。通常熒光顯微鏡部分配備兩個(gè)光源—鹵素?zé)艄庠春凸療艄庠础Ｆ潲u素?zé)艄庠从糜趯ふ覙悠方蛊矫妗⒂^察樣品位置、形態(tài)和分布；其汞燈用于觀察和分辨樣品中產(chǎn)生熒光物質(zhì)的成分和位置。對(duì)于光敏（例如猝滅）的樣品最好用其光鏡進(jìn)行預(yù)覽，以減少對(duì)樣品的刺激。2）掃描裝置：有可動(dòng)反光鏡、分光器、pinhole及檢測(cè)器等重要部件。檢測(cè)器采用高靈敏度的光電倍增

77、管（Photo Multiplier Tube; PMT）其檢測(cè)的范圍和靈敏度可根據(jù)樣品的強(qiáng)度進(jìn)行連續(xù)調(diào)節(jié)。將熒光圖像的強(qiáng)度按照0－255分級(jí)顯示。3）激光光源：常用的</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)采用激光掃描共聚焦顯微鏡采集圖像，可以保證圖像的清晰度和精準(zhǔn)度。</p><p>　　在利用激光掃描共聚焦顯微鏡獲取所需圖像之后，本實(shí)驗(yàn)使用ImageJ軟件進(jìn)行圖像的處理以及相關(guān)參數(shù)的采集。Ima

78、geJ軟件具有以下特征：1）適用范圍廣泛。ImageJ是一款功能強(qiáng)大的基于java的公共圖像處理軟件，由National Institutes of Health開發(fā)?？蛇\(yùn)行于Microsoft Windows，Mac OS，Mac OS X，Linux，和Sharp Zaurus PDA等多種平臺(tái)。能夠顯示，編輯，分析，處理，保存，打印8位，16位，32位的圖片， 支持TIFF, PNG, GIF, JPEG, BMP, DICOM,

79、 FITS等多種格式；2）軟件屬于開放資源。ImageJ軟件以及其java源代碼都是免費(fèi)提供的和公共的，使用者不需要提供任何證書；3）插件豐富。通過(guò)使用ImageJ軟件的文字編輯器組合以及java編輯器中的拓展插件可以延伸ImageJ軟件的功能。ImageJ軟件共有超過(guò)500個(gè)插件可供使用；4）分析功能強(qiáng)大。ImageJ軟件可以測(cè)量面積、平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、選取區(qū)域或整個(gè)區(qū)域的最大值和最小值等參數(shù)。測(cè)量長(zhǎng)度和角度?？梢允褂矛F(xiàn)實(shí)中使用的計(jì)量單

80、位，如微米</p><p>　　1.4 課題研究方法</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)將以SD大鼠為研究對(duì)象，選取其脛骨中段、尺骨中段以及顱骨中的頂骨作為切片材料，使用硬組織切片機(jī)將其進(jìn)行不包埋直接切片，利用激光掃描共聚焦顯微鏡采集陷窩圖像，并對(duì)圖像進(jìn)行處理，得到相關(guān)參數(shù)后進(jìn)行計(jì)算分析。</p><p>　　1）大鼠尾吊及振動(dòng)耦合被動(dòng)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練</p>&l

81、t;p>　　本實(shí)驗(yàn)將利用尾吊模型模擬失重環(huán)境，造成大鼠骨質(zhì)疏松。并在尾吊階段，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分設(shè)對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組（包括尾吊組、尾吊+振動(dòng)組（TSV）、尾吊+被動(dòng)運(yùn)動(dòng)組（TSP）、尾吊+振動(dòng)+被動(dòng)運(yùn)動(dòng)組（TSVP））對(duì)大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。</p><p>　　2）尾靜脈注射分子示蹤劑</p><p>　　在第一步實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將大鼠麻醉，按照每100g體重1毫升的劑量，對(duì)大鼠尾靜脈注

82、射0.8%的Reactive red分子示蹤劑。</p><p><b>　　3）硬組織切片制備</b></p><p>　　在骨切片制備階段，選用不脫鈣不包埋骨切片作為本課題的研究對(duì)象。所得脛骨、尺骨以及頂骨直接使用硬組織切片機(jī)（EXAKT,CT300,Germany）將其切成約0.1mm、0.1mm、0.15mm厚的切片。</p><p>

83、<b>　　4）圖像采集</b></p><p>　　利用硬組織切片機(jī)切成的脛骨、尺骨、頂骨骨切片，通過(guò)激光掃描共聚焦顯微鏡觀察熒光分布情況。由于所使用骨切片橫截面積都較大，因此本實(shí)驗(yàn)選取骨切片中較易辨認(rèn)定位的區(qū)域（脛骨3個(gè)區(qū)域、尺骨2個(gè)區(qū)域、頂骨3個(gè)區(qū)域）分別進(jìn)行觀察并獲取圖像。選取區(qū)域的具體位置如圖1.1。</p><p>　　5）參數(shù)的測(cè)量與計(jì)算分析</p

84、><p>　　圖像中骨陷窩、血管腔的面積、個(gè)數(shù)等相關(guān)參數(shù)可以通過(guò)本實(shí)驗(yàn)選取的ImageJ圖像分析軟件分析測(cè)量，并將得到的數(shù)據(jù)用SPSS軟件處理，分析得出結(jié)論。</p><p>　　(a)脛骨切片橫截面選取的3個(gè)區(qū)域；（b）尺骨切片橫截面選取的2個(gè)區(qū)域；</p><p>　?。╟）利用硬組織切片機(jī)制備的切片以及頂骨切片橫截面選取的3個(gè)區(qū)域.</p><

85、p>　　圖1.1 脛骨、尺骨、頂骨切片上選取的區(qū)域</p><p><b>　　2 實(shí)驗(yàn)方案</b></p><p><b>　　2.1 實(shí)驗(yàn)材料</b></p><p>　　2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料</p><p>　　實(shí)驗(yàn)所使用的25只8周齡雌性SD大鼠購(gòu)自于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限

86、公司，大鼠于無(wú)菌環(huán)境生長(zhǎng)，能保證身體健康狀況良好及大鼠間個(gè)體差異在實(shí)驗(yàn)可以接受的范圍內(nèi)，因此較適合于本實(shí)驗(yàn)。</p><p>　　2.1.2 實(shí)驗(yàn)器材</p><p>　　燒杯、廣口瓶、鑷子、載玻片、蓋玻片、量筒、膠頭滴管、大鼠尾吊箱、鼠籠、5mL一次性注射器、4號(hào)針頭、醫(yī)用紙質(zhì)膠布、脫脂棉、紗布、透氣橡皮膏、手術(shù)剪、大鼠限動(dòng)瓶、吹風(fēng)機(jī)等。</p><p>　　2

87、.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器</p><p>　　BS系列電子天平（北京塞多利斯天平有限公司）</p><p>　　硬組織切片機(jī)（德國(guó)EXAKT，CT300）</p><p>　　激光掃描共聚焦顯微鏡（德國(guó)Leica TCS SPE CTP6500）</p><p>　　micro-CT（比利時(shí)skyscan1076微型CT）</p>

88、<p>　　2.1.4 主要試劑</p><p>　　大鼠固體飼料（北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）</p><p><b>　　松息酊</b></p><p><b>　　安息香酊</b></p><p><b>　　生理鹽水</b></p><p

89、>　　100%乙醇（北京化工廠）</p><p>　　中性樹膠（天津光復(fù)精細(xì)化工研究所）</p><p>　　二甲苯溶液（北京化工廠）</p><p>　　Reactive red（60%）粉末（美國(guó)Sigma公司）</p><p><b>　　1%戊巴比妥鈉溶液</b></p><p>&

90、lt;b>　　PBS磷酸緩沖液</b></p><p>　　2.1.5 溶液配置</p><p><b>　　1）生理鹽水</b></p><p>　　稱取0.9g氯化鈉，溶解于少量蒸餾水中，稀釋到100mL。</p><p>　　2）1%戊巴比妥鈉溶液</p><p>　　稱

91、取戊巴比妥鈉1g，溶解于100mL蒸餾水中。</p><p>　　3）PBS磷酸緩沖液</p><p>　　分別稱取0.2gKCl，0.2gKH2PO4，8.0gNaCl，0.84gNa2HPO4（或1.56gNa2HPO4·7H2O、2.08gNa2HPO4·12H2O），溶解于1L純水中將PH調(diào)至7.2~7.4，分裝后放入4℃冰箱內(nèi)保存。</p>&l

92、t;p>　　4）Reactive red溶液</p><p>　　稱取Reactive red粉末1.4g，溶解到100mLPBS磷酸鹽緩沖液中，避光保存。</p><p><b>　　5）松香酊</b></p><p>　　將20g松香置于300g酒精浸泡3天。</p><p><b>　　6）安息香酊

93、</b></p><p>　　將安息香400g研細(xì)，加入適合乙醇（30%），靜置過(guò)夜，再加入乙醇（30%）至100mL。</p><p>　　2.2 大鼠尾吊及局部振動(dòng)耦合被動(dòng)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)</p><p>　　2.2.1 環(huán)境控制</p><p>　　25只雌性SD大鼠，均為購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司的清潔級(jí)大鼠，實(shí)

94、驗(yàn)開始當(dāng)天按平均體重配對(duì)，標(biāo)記采用電話按鍵式標(biāo)記，即將大鼠腹部分為九個(gè)區(qū)域分別標(biāo)記為1—9。例如：近右前肢側(cè)為1，腹中為5，近左后肢側(cè)為9，以此類推。頜下頸部為0。將標(biāo)號(hào)后的大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組4組（包括尾吊組（TS）、尾吊+振動(dòng)組（TSV）、尾吊+被動(dòng)運(yùn)動(dòng)組（TSP）、尾吊+振動(dòng)+被動(dòng)運(yùn)動(dòng)組（TSVP）），每組各5只。大鼠平均體重為：CON組：192.4g；TS組：195.7g；TSV組：192.8g；TSP組：192.4g；T

95、SVP組：191.1g。</p><p>　　3周尾吊以及局部振動(dòng)耦合被動(dòng)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練期間，給予充足的飲水和食物（鼠糧為北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料，其成分含量如下：粗蛋白：22.4%，粗脂肪：4.8%，粗灰分：6.78%，水分：10.6%，粗纖維：4.1%，鈣：1.18%，總磷：0.94%）；室溫保持在（25±2）℃，人工控制室內(nèi)照明，保持12h光照（8:00~20:00）和黑暗（20:0

96、0~次日8:00）交替循環(huán)。</p><p>　　2.2.2 局部振動(dòng)耦合被動(dòng)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練裝置的設(shè)計(jì)</p><p>　　整個(gè)裝置主要由大鼠尾吊固定組件、大鼠振動(dòng)/被動(dòng)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組件和振動(dòng)/被動(dòng)運(yùn)動(dòng)控制組件三部分組成，如圖2.1。大鼠尾吊固定組件以大鼠固定盒和尾吊懸梁為主，分別用來(lái)固定大鼠軀干和實(shí)施尾吊；大鼠振動(dòng)/被動(dòng)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組件用來(lái)對(duì)尾吊大鼠實(shí)施被動(dòng)耦合振動(dòng)訓(xùn)練；振動(dòng)/被動(dòng)運(yùn)動(dòng)控制組件對(duì)訓(xùn)練

97、進(jìn)行控制和量化。其中，訓(xùn)練大鼠的后肢被固定在腿部限制板上，直流電機(jī)連接單列滾子偏心軸承通過(guò)單向旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生振動(dòng)，通過(guò)偏心軸承的單向旋轉(zhuǎn)使小鼠腿部限制板產(chǎn)生振動(dòng)，且可以通過(guò)控制偏心輪偏心距大小，控制振動(dòng)的幅度；通過(guò)控制電子轉(zhuǎn)速，控制振動(dòng)裝置的振動(dòng)頻率。</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)選用的偏心軸承外徑（不包括滾子）為28mm，偏心距為0.5mm。偏心軸承每旋轉(zhuǎn)一圈就可以使運(yùn)動(dòng)軌跡限制板產(chǎn)生一次振動(dòng)。另外由于運(yùn)動(dòng)軌跡限制板是

98、被兩顆限位柱加橡膠圈固定住，而且軸承外圍的滾子有一定的活動(dòng)空隙，所以實(shí)際振幅是小于理論振幅的。另外目前公認(rèn)能夠有效維持骨量的振動(dòng)頻率在30Hz到90Hz之間，我們課題組已驗(yàn)證在35、45、55Hz的振動(dòng)頻率中，35Hz振動(dòng)對(duì)抗骨質(zhì)疏松的效果最好，而有些文獻(xiàn)中提到，高頻振動(dòng)可能引起骨裂，30Hz以上的振動(dòng)對(duì)機(jī)體有明顯損傷，所以我們選擇30Hz的振動(dòng)頻率，因此采用的直流電機(jī)最大轉(zhuǎn)速為1800r/min，當(dāng)直流電機(jī)最大電流工作時(shí)產(chǎn)生的振動(dòng)頻率

99、在30Hz左右，振幅小于0.5mm，加速度約為0.3g。</p><p>　　A：大鼠尾吊固定組件；B：大鼠振動(dòng)/被動(dòng)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組件；C：振動(dòng)/被動(dòng)運(yùn)動(dòng)控制組件.</p><p>　　圖2.1尾吊箱結(jié)構(gòu)圖</p><p>　　2.2.3 尾吊步驟</p><p>　　1）尾部皮膚表面準(zhǔn)備：用大鼠限動(dòng)瓶限制大鼠活動(dòng)。第一步用肥皂水清洗尾部表面并

100、用吹風(fēng)機(jī)吹干，之后依次向尾部表面噴涂安息香酊和松香酊，再次吹干，以防止粘貼物對(duì)皮膚的刺激作用，以上操作可以在一定程度上增大皮膚表面的粗糙度以防止尾吊膠布的滑脫。</p><p>　　2）大鼠尾部的粘貼固定：自一側(cè)尾根部起，按縱向走行，將一與尾部等寬的醫(yī)用膠布條，粘貼于尾部表面至距尾尖部3—5cm 處并留空一段膠布待用，接著，再將膠布條（不截?cái)啵┓聪蛘刍卣迟N至大鼠尾根部。在此段尾部的表面，再依次間斷地橫向圍繞2—3

101、圈膠布條對(duì)縱行膠布條加強(qiáng)固定。將一小團(tuán)脫脂棉固定于留空的膠布處，以防止膠布隨大鼠的活動(dòng)擰在一起從而對(duì)大鼠尾部皮膚造成傷害。由于大鼠的嚙咬習(xí)慣，可能會(huì)咬壞醫(yī)用膠布，從而導(dǎo)致懸吊條件的消失而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，解決辦法是可以在尾根醫(yī)用膠布上涂抹芥末水或者有苦味的碘酒等。</p><p>　　3）大鼠尾部的懸吊：用長(zhǎng)約10cm的膠布條將絞丁環(huán)與上一步驟中留空的膠布系在一起。再將絞丁環(huán)鉤在尾吊箱中鐵鏈的適當(dāng)位置上，使大鼠的后爪

102、在伸直時(shí)剛好不能觸及籠的底層，從而使動(dòng)物始終保持頭低位(約30度)</p><p>　　2.2.4 TSV組、TSP組、TSVP組以及CON組大鼠的處理</p><p>　　對(duì)照組（CON）的大鼠除了不尾吊外，其余條件與尾吊組（TS）相同，包括相同的環(huán)境，相同的喂養(yǎng)條件等。尾吊+振動(dòng)組（TSV）、尾吊+被動(dòng)運(yùn)動(dòng)組（TSP）、尾吊+振動(dòng)+被動(dòng)運(yùn)動(dòng)組（TSVP）的大鼠除與尾吊組（TS）在相同

103、環(huán)境下尾吊之外，每天上下午各根據(jù)分組利用局部振動(dòng)耦合被動(dòng)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練裝置對(duì)各組大鼠分別進(jìn)行一次訓(xùn)練，訓(xùn)練時(shí)長(zhǎng)均為200s，振動(dòng)頻率為30Hz，被動(dòng)運(yùn)動(dòng)每10s一次。在實(shí)驗(yàn)期間保證各組的基本生活環(huán)境，如室內(nèi)溫度、濕度等，喂養(yǎng)狀況相同，避免因外界不確定環(huán)境因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響。</p><p>　　2.2.5 實(shí)驗(yàn)期間的注意事項(xiàng) </p><p>　　1）每7天左右需要更換一次粘在大鼠尾部的膠

104、布，同時(shí)更換粘貼部位。通過(guò)這一操作，原來(lái)粘貼部位可能出現(xiàn)的膠布刺激癥狀或皮膚的輕度損傷可以很快恢復(fù)，同時(shí)由于其尾部不斷長(zhǎng)粗，經(jīng)常更換膠布條可以避免長(zhǎng)時(shí)間懸吊時(shí)引起的尾部缺血性損傷。</p><p>　　2）在21天的實(shí)驗(yàn)期間，每日觀察實(shí)驗(yàn)大鼠的各項(xiàng)體征以確保其身體健康，主要包括以下幾方面：a）大鼠整體表現(xiàn)及活動(dòng)情況；b）是否正常地進(jìn)行喝水、進(jìn)食；c）檢查尾部有無(wú)皮膚過(guò)敏、充血或壞死癥狀。一般情況下，尾吊鼠尾部的末

105、梢會(huì)出現(xiàn)輕微的應(yīng)激反應(yīng)，并無(wú)大礙。如果尾部有腫脹現(xiàn)象或者有壞死的皮膚，必須立刻更換膠布，并避開出現(xiàn)癥狀位置。另外，大鼠需要每天至少檢查兩次，保證沒(méi)有掉落。</p><p>　　2.3 脛骨micro-CT掃描與3D重建</p><p>　　在尾吊第0天和第22天，用1%的戊巴比妥鈉按照60mg/kg的劑量麻醉后，再確認(rèn)大鼠已處于麻醉狀態(tài)，即無(wú)明顯動(dòng)作且無(wú)動(dòng)眼反射時(shí)，將大鼠腹側(cè)朝上用膠帶固

106、定于樣品床內(nèi)進(jìn)行活體掃描。掃描設(shè)定參數(shù)為“70kV X線球管電壓，140μA電流，1mm鉛板過(guò)濾器，0.6°旋轉(zhuǎn)步進(jìn)角度”，考慮到需要保證掃描圖像的質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)中使用的活體掃描采用360°。掃描部位為脛骨近端。</p><p>　　掃描完成后，利用CTRecon軟件進(jìn)行重建，重建參數(shù)為：Ring artifacts-8；Beam hardening-32%。之后利用重建得出的圖像進(jìn)行相關(guān)參數(shù)的

107、計(jì)算，將計(jì)算結(jié)果通過(guò)SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析處理。</p><p>　　2.4 尾靜脈注射Reactive red溶液</p><p>　　尾靜脈注射Reactive red溶液的具體步驟如下：</p><p>　　1、大鼠的麻醉與固定。本實(shí)驗(yàn)采用1%的戊巴比妥鈉作為麻醉劑對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，麻醉劑用量為60mg/kg。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠的體重普遍在200g左右，故一

108、般注射0.8ml到1ml麻醉劑即可，由于本實(shí)驗(yàn)選擇在micro-CT掃描后進(jìn)行大鼠尾靜脈注射分子示蹤劑的操作，故如麻醉劑注射后五分鐘大鼠仍無(wú)明顯暈眩反應(yīng)，則可少量補(bǔ)充麻醉劑，最多不能超過(guò)0.3ml，以免造成大鼠死亡影響分子示蹤劑在體內(nèi)的循環(huán)?？紤]到本實(shí)驗(yàn)使用的Reactive red分子示蹤劑是有毒性的藥劑，因此應(yīng)盡可能減少麻醉劑的用量。如進(jìn)行尾靜脈注射時(shí)大鼠仍留有部分意識(shí)，應(yīng)在助手的協(xié)助下在不壓迫血管的前提下固定大鼠。</p&g