斯氏艾美爾球蟲(chóng)MIC-5與兔IL-6融合基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建.pdf

1、兔球蟲(chóng)病是由艾美爾科的多種球蟲(chóng)所引起的一種原蟲(chóng)性疾病，在我國(guó)很多地區(qū)感染十分普遍，以1～3月齡的幼兔感染率最高，可達(dá)100％，死亡率在70％左右，臨床上以腹瀉、生長(zhǎng)緩慢、消瘦為主要特征，給養(yǎng)兔業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的危害。病原學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，斯氏艾美爾球蟲(chóng)蟲(chóng)(E．stiedae)能引起嚴(yán)重的肝球蟲(chóng)病，是兔球蟲(chóng)中致病力最強(qiáng)、危害最大的一種球蟲(chóng)。目前，控制兔球蟲(chóng)病主要采用的是化學(xué)藥物方法，但隨著化學(xué)藥物殘留問(wèn)題日益突出和耐藥蟲(chóng)株的不斷出現(xiàn)，使得越來(lái)越多的

2、學(xué)者希望尋求免疫學(xué)方法進(jìn)行疫苗防控。同時(shí)，國(guó)內(nèi)外一些學(xué)者用分離的多種兔球蟲(chóng)蟲(chóng)株研制的兔球蟲(chóng)強(qiáng)毒活蟲(chóng)苗，通過(guò)免疫試驗(yàn)表明這種球蟲(chóng)活蟲(chóng)苗可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生一定的免疫力，但這種強(qiáng)毒活蟲(chóng)苗的接種會(huì)引起病原的大量擴(kuò)散，并且由于兔球蟲(chóng)種類繁多，若按常規(guī)方法研制廣譜的多價(jià)兔球蟲(chóng)疫苗也十分困難。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，核酸疫苗日益成為寄生蟲(chóng)病防治的新途徑。核酸疫苗具備操作方法簡(jiǎn)便，能同時(shí)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平保護(hù)性的體液和細(xì)胞免疫力，且安全、持效，有抗各種病

3、原體感染及抗腫瘤的廣闊應(yīng)用前景等優(yōu)點(diǎn)，因此，開(kāi)發(fā)有效的分子佐劑、DNA運(yùn)輸載體等，來(lái)提高兔球蟲(chóng)核酸疫苗的免疫效果，并增強(qiáng)其安全性具有重要意義。 本試驗(yàn)對(duì)E．stiedae孢子化卵囊抗原候選基因MIC-5基因進(jìn)行了克隆與表達(dá)，并對(duì)兔IL-6基因進(jìn)行了克隆、序列分析，構(gòu)建了Es MIC-5基因與兔IL-6基因的融合基因，并將該融合基因亞克降到原核表達(dá)載體PGEX—KG與真核表達(dá)載體pCDNA3.1(一)中，構(gòu)建出PGEX—MIC-5

4、-IL-6原核表達(dá)質(zhì)粒和pCDNA3.1(—)—MIC-5-IL-6真核表達(dá)質(zhì)粒，最后將真核表達(dá)質(zhì)粒免疫小鼠，以觀察兔IL-6基因?qū)s MIC-5基因核酸疫苗的免疫增強(qiáng)作用。 1重組質(zhì)粒pCDNA3.1(—)—Es MIC-5的構(gòu)建 通過(guò)飽和食鹽水漂浮法提純E．stiedae，并培養(yǎng)卵囊至孢子化。將保存的E．stiedae孢子化卵囊，加適量次氯酸鈉溶液處理，收集卵囊沉淀，將提純的E．stiedae吸入到用DEPC處理過(guò)

5、的滅菌組織勻漿器內(nèi)研磨30min，至使80％以上的孢子化卵囊被研破，后按Trizol試劑說(shuō)明書(shū)方法提取其總RNA，經(jīng)RT—PCR擴(kuò)增出一條約1100bp的片段，將此基因片段插入同樣酶切位點(diǎn)的原核表達(dá)載體PGEX—KG和真核表達(dá)載體pCDNA3.1(—)中，經(jīng)酶切鑒定、PCR擴(kuò)增鑒定，表明Es MIC-5基因已連接到原核表達(dá)載體PGEX—KG和真核表達(dá)載體pCDNA3.1(—)中。并將原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，于37℃IPTG

6、誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得表達(dá)，SDS—PAGE分析顯示，表達(dá)的Es MIC-5蛋白的分子量約為56Ku。 2．兔IL-6基因的克隆與序列分析 根據(jù)已公布的的歐洲兔IL-6基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，以兔脾臟中的總RNA為模板應(yīng)用兩步法RT—PCR擴(kuò)增兔IL-6基因，并經(jīng)酶切鑒定及序列測(cè)序，該兔IL-6基因的開(kāi)放閱讀框?yàn)?26bp。與同類歐洲兔、中國(guó)白兔IL-6基因的同源性為100％，與不同物種的水牛、野豬、雞、norway大鼠、小鼠、黃

7、牛、豬、馬的IL-6基因序列的同源性分別為：60.4％、64.3％、42.7％、54.3％、53.9％、61.2％、64.5％、65.4％，表明不同物種之間IL-6基因存在一定的種屬差異性。 3 MIC-5-IL-6融合基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)已報(bào)道的兔斯氏艾美爾球蟲(chóng)微線蛋白5(Es MIC-5)的核苷酸序列和兔白介素6基因序列另設(shè)計(jì)特異性引物，且在Es MIC-5基因引物上游引入EcoRⅠ位點(diǎn)、下游引入SalⅠ位點(diǎn)。以

8、EsMIC-5的總RNA為模板RT—PCR擴(kuò)增MIC-5基因，并將其克隆到pMD18—T中。再擴(kuò)增上游帶有SalⅠ位點(diǎn)、下游帶有HindⅢ位點(diǎn)的兔IL-6，同時(shí)將Es MIC-5插入到含有兔IL-6基因的質(zhì)粒pMD18—T—IL—6ˊ中，使兩個(gè)基因首尾相連，且Es MIC-5基因不含終止密碼子，兔IL-6基因不含起始密碼子。最后將融合基因片段定向克隆到原核表達(dá)載體pGEX—KG和真核表達(dá)載體pCDNA3.1(—)上，構(gòu)建成pGEX—MI

9、C-5-IL-6重組質(zhì)粒和pCDNA3.1(—)—MIC-5-IL-6重組質(zhì)粒。通過(guò)雙酶切鑒定，證明融合基因已克隆于原核表達(dá)和真核表達(dá)載體中。并將原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，于37℃ IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得表達(dá)。SDS—PAGE分析顯示，表達(dá)的PGEX—MIC-5-IL-6融合蛋白分子量約為85Ku。 將試驗(yàn)小鼠隨機(jī)分成4組，每組8只，分別為：pCDNA3.1(—)—MIC-5-IL-6核酸疫苗組(Ⅰ組)、pCDNA3.

10、1(—)—MIC-5核酸免疫組(Ⅱ組)、空載體pCDNA3.1(—)組(Ⅲ組)、空白對(duì)照組(Ⅳ組)。每組肌肉注射小白鼠100ug/只，間隔15d，進(jìn)行三次免疫。Ⅳ空白對(duì)照組按相同程序注射滅菌生理鹽水。在首免與二免后15天，分別進(jìn)行尾靜脈采血；第3次免疫一周后進(jìn)行眼眶采血，分離血清，通過(guò)ELISA檢測(cè)免疫小鼠外周血IL-2、INF—γ結(jié)果為：一免和二免，pCDNA3.1(—)—MIC-5-IL-6核酸疫苗免疫組(Ⅰ組)IL-2、IFN—γ