中藥藥理、中藥免疫研究和中獸藥研發(fā)工作. 當(dāng)歸不同藥用部位水提液體外清除自由基作用研究

1、<p>　　中藥藥理、中藥免疫研究和中獸藥研發(fā)工作. 當(dāng)歸不同藥用部位水提液體外清除自由基作用研究</p><p>　　作者：華永麗，郭延生，鄧紅娟，程越山，曲亞玲，魏彥明 </p><p>　　【摘要】 目的研究生當(dāng)歸、當(dāng)歸頭、當(dāng)歸身、當(dāng)歸尾的水提取液體外對(duì)羥自由基(·OH)和氧自由基(O2-·)的清除作用。方法應(yīng)用分光光度法測定不同當(dāng)歸水提液對(duì)Fento

2、n反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基(·OH)和鄰苯三酚自氧化產(chǎn)生的氧自由基(O2-·)的清除能力。結(jié)果當(dāng)歸不同部位水提液在受試濃度范圍內(nèi)對(duì)羥自由基和氧自由基有明顯的抑制作用，隨當(dāng)歸及其不同部位水提液濃度的增加，抑制率明顯升高，呈明顯的量效關(guān)系，對(duì)羥自由基的清除能力依次為生當(dāng)歸&gt;當(dāng)歸身≈當(dāng)歸頭&gt;當(dāng)歸尾，對(duì)氧自由基的清除能力依次為當(dāng)歸身≈生當(dāng)歸&gt;當(dāng)歸頭&gt;當(dāng)歸尾。結(jié)論當(dāng)歸不同部位水

3、提液體外均具有較好的清除自由基的作用，不同藥用部位在清除氧自由基和羥自由基能力上表現(xiàn)不同。 </p><p>　　【關(guān)鍵詞】 當(dāng)歸; 不同部位; 水提液; 羥自由基; 氧自由基</p><p>　　Abstract：ObjectiveTo study the effect of water extracts of different parts of Radix Angelicae Si

4、nensis on hydroxyl radicals and oxygen free radicals.MethodsThe inhibition rate of water extracts of different processed products of Radix Angelicae Sinensis on free radical in vitro were detected by spectrophotometry. R

5、esultsThe results showed that water extracts from different parts of Radix Angelicae Sinensis in vitro had significant scavenging effects on hydroxyl radical. Furthermore , the extract</p><p>　　Key words： Ra

6、dix Angelicae Sinensis; Different parts; Water extracts; Hydroxyl radicals; Oxygen free radical</p><p>　　當(dāng)歸為傘形科當(dāng)歸屬植物當(dāng)歸Angelica sinesis (Oliv.)Diels.的干燥根，主產(chǎn)于甘肅岷縣等地，屬甘肅道地藥材，是中(獸)醫(yī)臨床常用藥，性溫，味甘、辛，具有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤燥滑腸

7、等功效[1]。中醫(yī)藥傳統(tǒng)理論和臨床經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為，當(dāng)歸不同藥用部位具有不同的藥效。現(xiàn)代藥理研究表明，當(dāng)歸在心血管系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、抗損傷及保護(hù)方面均顯示良好的藥理作用，且具有一定的抗氧化和清除自由基的作用，對(duì)腦缺氧、缺血后再灌注腦組織脂質(zhì)過氧化增高具有明顯的抑制作用[2]，而中藥抗氧化的作用機(jī)制是清除機(jī)體在正常細(xì)胞代謝中產(chǎn)生的超氧陰離子自由基、羥自由基、過氧化氫、單線態(tài)氧等自由基[3]。為此,本實(shí)驗(yàn)分別以超氧陰離子和羥自由基為檢測指標(biāo)

8、，研究當(dāng)歸不同藥用部位抗氧化作用的異同，以期從生物學(xué)角度探討當(dāng)歸不同藥用部位入藥的依據(jù)。</p><p><b>　　1 材料與儀器</b></p><p>　　1.1 藥物和試劑生當(dāng)歸采于甘肅岷縣(經(jīng)甘肅中醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)系龍全江副教授和甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院中獸醫(yī)教研組鑒定為傘形科當(dāng)歸屬植物當(dāng)歸)，取原藥材，除去雜質(zhì)，洗凈，潤透，分頭、身、尾切成薄片，曬干或低溫干燥。

9、無水乙醇、FeSO4·7H2O、水楊酸、H2O2、鄰苯三酚、鹽酸、L-抗壞血酸等均為分析純;三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)為進(jìn)口上海中秦化學(xué)試劑有限公司分裝。</p><p>　　1.2 儀器RE-6000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮)，TBZ5-WS多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)(湘儀)，HH-501超級(jí)恒溫水浴箱，OPPON-3000型紫外/可見光分光光度計(jì)(韓國)，CW-2000型超聲-微波協(xié)同萃取儀，AL104

10、電子分析天平，SHB-III循環(huán)水式多用真空泵，C型玻璃儀器氣流烘干器，XW-80型旋渦混合器等。</p><p><b>　　2 方法</b></p><p>　　2.1 當(dāng)歸水提液制備分別取生當(dāng)歸、當(dāng)歸頭、當(dāng)歸尾、當(dāng)歸身各100 g，加蒸餾水300 ml，85 ℃超聲-微波協(xié)同提取2次，每次30 min。合并兩次提取液，減壓濃縮至質(zhì)量濃度1 g/ml。4 ℃保存?zhèn)?/p>

11、用。</p><p>　　2.2 羥自由基體系參照Fenton反應(yīng)的方法建立反應(yīng)體系模型[4,5]，采用固定反應(yīng)時(shí)間法[6,7]，在相同體積的反應(yīng)體系(6 mmol/L的H2O2 1 ml，6 mmol/L的Fe2+ 1 ml，6 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液 1 ml)分別加入不同濃度的生當(dāng)歸、當(dāng)歸頭、當(dāng)歸尾和當(dāng)歸身水提液1 ml，設(shè)置5個(gè)濃度組(質(zhì)量濃度分別為5，10，20，40，80 mg/ml)，每個(gè)濃

12、度設(shè)10個(gè)平行管。以蒸餾水為參比，在510 nm處測量各濃度下的吸光度，通過公式計(jì)算其清除率。以L-抗壞血酸為陽性藥物對(duì)照，質(zhì)量濃度分別為0.15，0.20，0.25，0.30，0.35 mg/ml共5個(gè)濃度組，每個(gè)濃度設(shè)10個(gè)平行管。</p><p>　　公式：清除率(%)=[Ai-(Aj-Ad)]/Ai×100%</p><p>　　Ai為空白對(duì)照液的吸光度;Aj為加入藥物溶

13、液后的吸光度;Ad為不加顯色劑H2O2藥物溶液本底的吸光度。</p><p>　　2.3 氧自由基體系[8,9]采用鄰苯三酚自氧化法[10～12]：鄰苯三酚在弱堿性介質(zhì)中自氧化分解產(chǎn)生O2-·，利用O2-·清除劑能使鄰苯三酚自氧化產(chǎn)物在325 nm處的吸收峰受到抑制這一特點(diǎn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照管和加藥管，對(duì)照組管設(shè)5個(gè)平行管，分別加入50 mmol/L的Tris-HCl緩沖溶液(pH 8.2

14、，含1 mmol/L 二乙基三氨基五乙酸)4.5 ml，加入4.2 ml雙蒸水，混勻后25 ℃水浴保溫20 min，取出后立即加入25 ℃水浴中預(yù)熱的6 mmol/L的鄰苯三酚0.3 ml (以10 mmol/L HCl代替鄰苯三酚作為空白)，混勻后立即倒入比色杯，于325 nm處每隔30 s測A值1次，共測5 min，計(jì)算對(duì)照管溶液吸光度隨時(shí)間的變化率。加藥組設(shè)5個(gè)平行管，在加入鄰苯三酚前先加入1.0 ml當(dāng)歸提取液(設(shè)質(zhì)量濃度分別為

15、25，50，100，200 mg/ml共4個(gè)濃度梯度)，再加入3.2 ml雙蒸水，混勻后25 ℃水浴保溫20 min，取出后立即加入在25 ℃水浴中預(yù)熱的6 mmol/L鄰苯三酚0.3 ml，混勻后立即倒入比色杯，于325 nm處每隔30 s測A</p><p>　　公式：清除率(%)=(⊿A-⊿A0)/⊿A×100%</p><p>　　⊿A：表示對(duì)照管鄰苯三酚自氧化變化速率;

16、⊿A0：表示加藥管鄰苯三酚自氧化變化速率)便能測定被測物對(duì)O2-·的清除作用。</p><p>　　2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析、回歸分析和線性相關(guān)，測定結(jié)果以±s表示，以(P&lt;0.05)為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。</p><p><b>　　3 結(jié)果</b></p><p>　　3.1 當(dāng)歸不

17、同藥用部位水提液對(duì)羥自由基的清除作用由表1可以看出當(dāng)歸不同部位水提液在不同實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)都表現(xiàn)出不同的對(duì)羥自由基清除能力(P&lt; 0.05)，隨著不同當(dāng)歸水提液濃度的增加，抑制率明顯增加，表明均呈明顯的量效關(guān)系(r值分別為生當(dāng)歸0.971、當(dāng)歸頭0.960、當(dāng)歸身0.946、當(dāng)歸尾0.961，P&lt; 0.05)。由表3可以看出不同藥用部位IC50從小到大依次為生當(dāng)歸、當(dāng)歸身、當(dāng)歸頭、當(dāng)歸尾，即生當(dāng)歸水提物對(duì)羥自由

18、基的清除能力依次為生當(dāng)歸&gt;當(dāng)歸身≈當(dāng)歸頭&gt;當(dāng)歸尾。表1 當(dāng)歸不同部位水提液對(duì)羥自由基的清除作用</p><p>　　3.2 當(dāng)歸不同藥用部位水提液對(duì)氧自由基的清除作用由表2可以看出當(dāng)歸不同部位水提液在不同實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)都表現(xiàn)出不同的對(duì)氧自由基清除能力(P&lt; 0.05)，隨著不同當(dāng)歸水提液濃度的增加，抑制率明顯增加，表明均呈明顯的量效關(guān)系(r值分別為生當(dāng)歸0.983、當(dāng)歸頭

19、0.946、當(dāng)歸身0.915、當(dāng)歸尾0.926、，P&lt; 0.05)。由表3可以看出不同藥用部位IC50從小到大依次為當(dāng)歸身、生當(dāng)歸、當(dāng)歸頭和當(dāng)歸尾，即生當(dāng)歸及其炮制品水提物對(duì)氧自由基的清除能力依次為當(dāng)歸身≈生當(dāng)歸&gt;當(dāng)歸頭&gt;當(dāng)歸尾。</p><p><b>　　4 討論</b></p><p>　　體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，生當(dāng)歸、當(dāng)歸

20、頭、當(dāng)歸尾、當(dāng)歸身水提取物能清除反應(yīng)體系產(chǎn)生的O2-·和Fenton 系統(tǒng)產(chǎn)生的·OH，均具有良好的量效關(guān)系，其均具有一定的抗氧化作用。當(dāng)歸不同藥用部位抗氧化作用存在一定差異性，清除羥自由基能力為生當(dāng)歸&gt;當(dāng)歸身≈當(dāng)歸頭&gt;當(dāng)歸尾。清除氧自由基的能力為當(dāng)歸身≈生當(dāng)歸&gt;當(dāng)歸頭&gt;當(dāng)歸尾。不同藥用部位在清除氧自由基和羥自由基能力上表現(xiàn)不同　表2 當(dāng)歸不同部位水提液對(duì)氧自由

21、基清除作用　表3 當(dāng)歸不同藥用部位水提液對(duì)氧自由基羥自由基半數(shù)抑制率　　L-抗壞血酸氧自由基12.9913.7113.4317.000.18羥自由基63.3284.1661.496.230.104</p><p>　　據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，當(dāng)歸中的化學(xué)成分為苯酞類、香豆素類、黃酮類、揮發(fā)油類、有機(jī)酸類、多糖類化合物及其他成分。在當(dāng)歸的這些化學(xué)成分中，除香柑內(nèi)酯等呋喃香豆素外，其他類化學(xué)成分幾乎都與抗氧化有關(guān)[13]，其中阿

22、魏酸[14]、揮發(fā)油[13]和多糖[15]都被認(rèn)為是抗氧化的主要成分作用，而這3類成分現(xiàn)在被普遍認(rèn)為是當(dāng)歸的主要成分。當(dāng)歸不同藥用部位中，揮發(fā)油、阿魏酸含量以歸尾最高，歸頭最低[16]，這個(gè)結(jié)果與實(shí)驗(yàn)所得當(dāng)歸頭的清除氧自由基和羥自由基能力強(qiáng)于當(dāng)歸尾不一致，說明當(dāng)歸不同藥用部位清除自由基的能力是多種化學(xué)成分協(xié)同作用的結(jié)果，也正是中藥多成分、多靶點(diǎn)作用的結(jié)果。當(dāng)歸不同藥用部位提取物中含量及相互間的比例有所變化，這些成分之間協(xié)同作用，共同表現(xiàn)

23、為清除氧自由基和羥自由基的不同能力，而究竟是如何協(xié)同作用，還有待進(jìn)一步分析不同藥用部位的化學(xué)成分變化。</p><p>　　中醫(yī)藥傳統(tǒng)理論和臨床經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為，止血用當(dāng)歸頭，補(bǔ)血用當(dāng)歸身，破血用當(dāng)歸尾，和血(即補(bǔ)血活血)用全當(dāng)歸。本實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果也表明當(dāng)歸不同藥用部位清除氧自由基和羥自由基的能力不同，因此提示當(dāng)歸的分部位用藥和炮制入藥有一定的意義，為中醫(yī)藥傳統(tǒng)理論的驗(yàn)證提供了佐證。</p><p>

24、;　　綜上所述，不同藥用部位之間在清除氧自由基和羥自由基能力上表現(xiàn)不同，這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果與當(dāng)歸不同藥用部位的化學(xué)成分變化進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其抗氧化能力可能不是單一成分作用的結(jié)果，而是多個(gè)成分協(xié)同作用，提示中藥的研究不能以單一成分為指標(biāo);而中藥不同部位入藥的每個(gè)細(xì)節(jié)都與臨床息息相關(guān)，在評(píng)價(jià)當(dāng)歸不同藥用部位作用時(shí)需要考慮的這一問題,需選擇多種具有代表性的指標(biāo)進(jìn)行研究，以期獲得較為科學(xué)地闡明其分部位用藥原理及功效。</p><p&

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