鐮刀菌毒素對豬的抗營養(yǎng)效應(yīng)及其機制研究.pdf

1、本研究在考察自然霉變玉米污染飼糧對斷奶仔豬生產(chǎn)性能和營養(yǎng)物質(zhì)利用影響的基礎(chǔ)上，以原代培養(yǎng)豬小腸上皮細胞為模型，進一步研究鐮刀菌毒素脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮單獨或聯(lián)合作用對豬小腸上皮細胞的增殖、損傷、相關(guān)消化酶活性和養(yǎng)分吸收的影響以及與相關(guān)消化酶及轉(zhuǎn)運載體基因表達之間的關(guān)系。研究共包括四個試驗。 試驗一自然霉變玉米污染飼糧對斷奶仔豬生產(chǎn)性能及營養(yǎng)物質(zhì)消化代謝的影響 本試驗研究了自然霉變玉米污染飼糧對斷奶仔豬生產(chǎn)性能

2、、器官相對重、小腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)、養(yǎng)分利用率和血清生化參數(shù)的影響。采用單因素試驗設(shè)計，將75頭始重為8.04±0.64kg的去勢約×榮仔豬，隨機分為3組，每組5個重復(fù)，每組隨機接受一種試驗飼糧。試驗飼糧用自然霉變的玉米分別以25％和50％的比例等量替換基礎(chǔ)飼糧中的正常玉米配制而成，以基礎(chǔ)飼糧為對照組，進行28 d試驗。結(jié)果表明； 1.霉玉米污染的飼糧，降低了仔豬的生產(chǎn)性能，隨飼糧中霉玉米替代比例的增加，采食量和日增重呈線性或二次曲

3、線下降。 2.隨飼糧中霉玉米替代比例的增加，腎臟相對重呈二次曲線下降，脾臟相對重呈線性增加，而肝、胰、胸腺的相對重不受影響。25％霉玉米飼糧降低膽囊相對重。 3.隨飼糧中霉玉米替代比例的增加，十二指腸和空腸前段的絨毛高度和黏膜厚度呈線性或二次曲線降低，十二指腸前段隱窩呈線性加深，空腸前段隱窩呈線性或二次曲線加深（P<0.05），各腸段絨毛寬度受到顯著影響（P<0.05或P<0.01）。 4.有機物質(zhì)、蛋白質(zhì)、磷的

4、表觀消化率和蛋白質(zhì)生物學(xué)價值隨飼糧中霉玉米替代比例的增加呈線性或二次曲線降低（P<0.05），鈣的表觀消化率呈線性降低（P<0.05）。 5.隨飼糧中霉玉米替代比例的增加，試驗進行至第14 d豬血清中GPT活性和ALB濃度呈二次曲線降低（P<0.05），在28 d卻無變化（P>0.05）。血清TP濃度在14 d不受影響（P>0.05），28 d呈現(xiàn)二次變化（P<0.05）。血清GLO、A/G和BUN不受影響，IgG、IgA、Ig

5、M的濃度前后無變化（P>0.05）。 本研究結(jié)果揭示，自然霉變玉米污染飼糧導(dǎo)致仔豬生產(chǎn)性能下降、小腸黏膜結(jié)構(gòu)損傷、養(yǎng)分表觀消化率下降以及部分血清生化指標受到影響。 試驗二 鐮刀菌毒素對仔豬腸上皮細胞增殖及氧化損傷的影響 本試驗以原代培養(yǎng)的新生仔豬腸上皮細胞（porcine intestinal epithelium cell，pIEC）為研究模型，采用4×4因子試驗設(shè)計，研究DON和ZEN對pIEC增殖及氧化損

6、傷的影響。DON終濃度分別為0、2、4和6μg/mL，ZEN終濃度分別為0、1、5和10μg/mL，試驗共16個處理。將細胞懸液接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每個處理設(shè)11個重復(fù)孔，其中每個處理的5個重復(fù)，在細胞貼壁培養(yǎng)至第6 d，分別攻毒培養(yǎng)3、6、12、24和48 h后，采用MTT法分析細胞增殖；每個處理余下的6個重復(fù)孔中的細胞繼續(xù)培養(yǎng)至第10 d后，攻毒培養(yǎng)24 h，用于LDH分析。細胞懸液接種于24孔細胞培養(yǎng)板，每個處理設(shè)10個重復(fù)

7、孔，細胞貼壁培養(yǎng)至第10d，攻毒培養(yǎng)24 h，用于氧化應(yīng)激指標測定。結(jié)果表明： 1.DON在2 μg/mL、ZEN在5μg/mL及以上濃度單獨或聯(lián)合作用于pIEC顯著降低其增殖。兩毒素聯(lián)合作用于pIEC，對降低其增殖存在顯著的互作效應(yīng)（P<0.01），DON對細胞增殖的抑制效應(yīng)比ZEN大。 2.DON在2μg/mL、ZEN在10μg/mL及以上濃度單獨或聯(lián)合作用于pIEC顯著增加乳酸脫氫酶（lactate dehydro

8、genase，LDH）的逸出率。DON對pIEC膜的損傷作用比ZEN大。 3.DON在2μg/mL、ZEN在5μg/mL及以上濃度單獨作用于pIEC，顯著增加丙二醛（malondialdehyde，MDA）生成量（P<0.05）。兩毒素聯(lián)合作用于pIEC，DON使MDA顯著增加的最低危害作用水平（lowest observed adverse effect level，LOAEL）是4μg/mL，DON、ZEN對MDA的生成量有

9、極顯著的交互效應(yīng)（P<0.01），DON對MDA生成量的影響比ZEN大。 4.DON單獨或與ZEN聯(lián)合作用顯著降低pIEC內(nèi)谷胱甘肽（GSH）含量和超氧化物歧化酶（T-SOD）活性的LOAEL是2μg DON/mL。ZEN單獨作用顯著降低GSH含量的LOAEL是1μg/mL（P<0.05），顯著降低T-SOD活性的LOAEL是10 μg/mL。兩毒素聯(lián)合作用于pIEC，ZEN降低GSH含量的LOAEL是1μg/mL，降低T-SO

10、D活性的LOAEL是5μgZEN/mL。 5.DON、ZEN聯(lián)合作用pIEC，降低細胞內(nèi)GSH含量和T-SOD活性的程度大于毒素各自的單一作用。對細胞抗氧化系統(tǒng)的損傷DON比ZEN強，并在降低GSH含量上表現(xiàn)出亞加性效應(yīng)。 上述試驗結(jié)果表明，DON、ZEN可造成pIEC的氧化損傷并抑制其增殖，對細胞氧化損傷作用的大小為：DON>ZEN。 試驗三 鐮刀菌毒素對仔豬腸上皮細胞養(yǎng)分消化吸收的影響 試驗二表明，

11、DON和ZEN引起pIEC氧化損傷，導(dǎo)致細胞膜完整性受損，因此會影響?zhàn)B分的消化吸收。為了探索DON、ZEN對原代培養(yǎng)pIEC黏膜酶活及養(yǎng)分吸收的影響，本試驗采用3×3因子設(shè)計，DON的濃度設(shè)為0、2、4μg/mL，ZEN濃度設(shè)為0、5、10μg/mL，試驗共9個處理，每個處理設(shè)10個重復(fù)孔，考察DON、ZEN對pIEC的蔗糖酶、異麥芽糖酶、Na*-K+ATPase活性及葡萄糖和二肽（以頭孢氨芐為底物）吸收的影響。結(jié)果表明： 1.

12、DON單獨作用于pIEC，降低蔗糖酶活性、葡萄糖和頭孢氨芐吸收的LOAEL是2μgDON/mL（P<0.05），降低麥芽糖酶和Na+-K+ATPase活性的LOAEL是4 μgDON/mL（P<0.05）。 2.ZEN單獨作用于pIEC，降低蔗糖酶和Na+-K+ATPase活性及葡萄糖吸收的LOAEL是10μg/mL（P<0.05），降低頭孢氨芐吸收的LOAEL是5μg ZEN/mL，對麥芽糖酶的活性無顯著影響（P>0.05）.

13、 3.DON與ZEN聯(lián)合作用于pIEC，在一定的濃度范圍內(nèi)以加性或亞加性效應(yīng)的方式降低蔗糖酶、麥芽糖酶和Na+-K+ATPase的活性（P<0.01）。DON與低濃度ZEN聯(lián)用在降低葡萄糖的吸收上表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)，與高濃度ZEN聯(lián)用在降低葡萄糖的吸收上表現(xiàn)亞加性效應(yīng)（P<0.05），而對頭孢氨芐的吸收無交互作用（P>0.05）。 上述結(jié)果揭示，DON和ZEN對pIEC蔗糖酶、麥芽糖酶和Na+-K+ATPase活性及葡萄糖和

14、頭孢氨芐的吸收有顯著影響，對蔗糖酶活性、Na+-K+ATPase活性、葡萄糖及頭孢氨芐吸收的影響，DON比ZEN敏感，而對麥芽糖酶活性的影響，在兩者聯(lián)合作用時，ZEN比DON敏感。 試驗四 鐮刀菌毒素對仔豬腸上皮細胞養(yǎng)分消化吸收相關(guān)酶及轉(zhuǎn)運載體基因表達的影響 試驗三揭示，DON和ZEN影響了pIEC黏膜酶活及養(yǎng)分吸收，因此本試驗采用3×3因子設(shè)計，進一步探究DON、ZEN影響?zhàn)つっ富罴梆B(yǎng)分吸收的可能機制。DON的濃度設(shè)

15、為0、2、4μg/mL，ZEN濃度設(shè)為0、5、10μg/mL，試驗共9個處理，每個處理設(shè)3個重復(fù)孔，采用SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR考察了DON、ZEN對蔗糖酶-異麥芽糖酶（sucrase-isomaltase，SI）、亮氨酰氨肽酶（leucylaminopeptidase，LAP）、Na+-葡糖共轉(zhuǎn)運載體（Na+/glucose cotransport transporter，SGLT1）和二肽轉(zhuǎn)運載體（dipeptid

16、e transporter，PepT1）基因表達的影響。結(jié)果表明： 1.DON使SI、LAP及PcpT1 mRNA表達水平下調(diào)的LOAEL為2 μg/mL（P<0.05），在低水平（2 μg/mL）可使SGLT1 mRNA表達下調(diào)（P<0.05），較高水平（4 μg/mL）對SGLT1 mRNA的表達無影響（P>0.05）。 2.ZEN單獨作用不影響S工和PepT1 mRNA的表達（P>0.05），在10μg ZEN/m

17、L使LAP和SGL71 mRNA的表達水平下調(diào)（P<0.05）。 3.DON、ZEN聯(lián)合作用于pIEC，DON使SI、LAP、SGLT1及PepT1的mRNA表達水平下調(diào)的LOAEL為2 μg/mL（P<0.05），ZEN不影響上述指標mRNA的表達（P>0.05）。DON與ZEN協(xié)同下調(diào)SI和PepT1 mRNA的表達，對LAP和SGLT1 mRNA的表達無互作效應(yīng)。 上述結(jié)果揭示，DON可下調(diào)SI、LAP、SGLT1

18、及PepT1mRNA的表達，ZEN對LAP和SGLT1 mRNA的表達有輕微的下調(diào)作用。DON與ZEN協(xié)同下調(diào)SI和PepT1 mRNA的表達，DON對消化相關(guān)酶活性及轉(zhuǎn)運載體mRNA表達的影響比ZEN大。 上述體內(nèi)和體外試驗結(jié)果表明，鐮刀菌毒素DON、ZEN通過抑制細胞增殖、損害pIEC內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)使細胞受損，從而導(dǎo)致動物消化道形態(tài)結(jié)構(gòu)異常，并通過下調(diào)相關(guān)消化酶及轉(zhuǎn)運載體的基因表達，降低養(yǎng)分吸收而導(dǎo)致動物生產(chǎn)性能下降，表現(xiàn)出