rt┐pcr分析肉芽組織生長過程中vegf及β3整合素mrna的表達_第1頁
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文檔簡介

1、<p>  RT┐PCR分析肉芽組織生長過程中VEGF及β3整合素mRNA的表達</p><p>  作者:張聚良 王嶺 晉援朝 黃慶生 金衛(wèi)林 </p><p>  【關鍵詞】 逆轉錄-PCR </p><p>  關鍵詞: 逆轉錄-PCR;新生血管化,病理性;內皮生長因子;結合素類 </p><p>  摘 要:目的 觀察

2、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及β3整合素mRNA在肉芽組織血管生成中表達的動態(tài)變化. 方法 采用RT-PCR法定量分析人正常皮下組織、增殖期肉芽組織(傷后7~12d)及成熟期肉芽組織(傷后30~35d)VEGF及β3整合素mRNA的水平. 結果 在正常皮下組織中,VEGF及β3整合素mRNA呈低表達,而在增殖期肉芽組織中表達升高,待肉芽組織完全成熟后二者的表達又有

3、所降低. 結論 VEGF及β3整合素mRNA的水平與肉芽組織的血管生長過程呈動態(tài)相關,提示兩種蛋白質可能在肉芽組織血管生成中發(fā)揮調節(jié)作用. </p><p>  Keywords:reverse transcription PCR;neovascularization,pathologic;endothelial growth factors;integrins </p><p>  A

4、bstract:AIM To observe the dynamic changes in the ex-pression of vascular endothelial growth factor(VEGF)and integrinβ3mRNA during the angiogenetic process of granula-tion tissue.METHODS VEGF and integrinβ3mRNA inhuman n

5、ormal subcutaneous tissue,proliferative granulation tissue(7~12days post-injured)and mature granulation tis-sue(30~35days post-injured)were quantitatively analyzed with RT-PCR.RESULTS In normal subcutaneous tissue,VEGF a

6、nd integrinβ3mRNA were expressed low while in proliferative</p><p><b>  0 引言 </b></p><p>  血管生成指在已有血管床基礎上長出新的毛細血管的過程,包括血管內皮細胞的激活,細胞外基質的降解,內皮細胞的增殖、移行,管腔結構形成及血管外膜的形成,然而迄今為止確切的機制尚不清楚.已有

7、研究表明,許多病理過程如腫瘤的生長及轉移、糖尿病視網膜病變、類風濕性關節(jié)炎等,都與血管生成密切相關[1] .生理狀態(tài)下,血管生成僅存在于胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷愈合及女性生殖周期中,與病理性血管生成不同,這些過程中血管的生長受到嚴格調控,包括了增殖、成熟、退化三個階段,反映了血管生成的全過程.然而,對這些過程中血管生成的研究卻很少.生長因子和粘附分子作為血管生成的重要調節(jié)分子,越來越受到人們的重視,其中血管內皮生長因子(vas-cular end

8、othelial growth factor,VEGF)和β3整合素是近年研究的熱點.本實驗旨在觀察肉芽組織生長過程中VEGF及β3整合素mRNA的表達,揭示它們與生理性血管生成的關系. </p><p><b>  1 材料和方法 </b></p><p>  1.1 材料 肉芽組織標本均取自我院門診換藥室患者,4例為皮膚撕脫傷,1例為狗咬傷,患者年齡20~30歲

9、,排除糖尿病等影響傷口愈合的疾患,分別于傷后7~12d和30~35d取創(chuàng)面組織.正常皮下組織取自我院手術患者. </p><p>  1.2 試劑及儀器 異硫氰酸胍、Sarcosyl,AMV逆轉錄酶、Taq酶、dNTP,RNAsin分別購自原平生物公司和Promga公司;DNA THERMAL CYCLER480,美國PE公司;GDS凝膠成像系統,美國UVP公司. </p><p>  

10、1.3 RT┐PCR </p><p>  1.3.1 引物設計 按文獻報道[2,3],VEGF上游引物序列:5’-GCACCCATGGCAGAAGGAGGAG-3’,下游引物序列:5’-GTGCTGACGC-TAACTGACC-3’,PCR產物為567bp,495bp和363bp,β3整合素上游引物序列:5’-GTGCT-GACGCTAACTGACC-3’,下游引物序列:5’-CATGGTAGTGGAGGCA

11、GAGT-3’,PCR產物為285bp. </p><p>  1.3.2 總RNA提取及定量 所取組織用Chom-czynski改良一步法提取總RNA,通過測定A260 值計算RNA濃度,A260 /A280 判定純度. </p><p>  1.3.3 RT-PCR反應 各組織總RNA均取1μg(10μL),加25μmol&#12539;L-1 逆轉錄引物(下游引物)1μL

12、,70℃10min后立刻冰浴,加入下列成分:DW5μL,5x RT緩沖液5μL,10mmol&#12539;L-1 dNTP各1μL,RNasin0.5μL(25U),AMV1μL(5U),42℃逆轉錄1h,94℃5min,冰浴5min.各取RT產物10μL,進行PCR擴增,反應條件同于常規(guī)PCR,循環(huán)溫度為:94℃1min,55℃1min,72℃2min,循環(huán)數分別采用15,20,25和30,根據結果選擇合適循環(huán)數,避免PCR

13、反應平臺期,最終確定為25個循環(huán),0.2g&#12539;L-1 瓊脂糖凝膠觀察結果. </p><p>  1.3.4 熒光分析 瓊脂糖凝膠電泳結束后,在UVP凝膠成像系統上攝像,并用相應軟件通過對條帶大小及深淺的差別分別對不同組織RT-PCR擴增產物進行定量分析,結果采用完全隨機化設計資料均數的t檢驗進行統計分析. </p><p><b>  2 結果 </

14、b></p><p>  VEGF有多種不同的mRNA拼接產物,本實驗選用引物可擴增出VEGF121 (363bp),VEGF165 (495bp)和VEGF189 (567bp)3種形式.電泳結果表明,VEGF可見3條擴增帶,大小同預期設計一致(Fig1)β3整合素PCR產物為265bp,電泳顯示300bp附近可見明顯擴增帶,與預期一致(Fig2)由電泳結果可以看出,正常皮下組織中VEGF及β3整合素mR

15、-NA水平極低,在增殖期肉芽組織中表達明顯升高,在成熟期肉芽組織中表達又降低,而且,在VEGF的 3種不同拼接產物中,VEGF165 表達最高. </p><p>  圖像分析定量的結果表明,在增殖期肉芽組織中,VEGF及β3整合素mRNA水平高于成熟期肉芽組織(P&lt;0.05)及正常皮下組織(P&lt;0.01,Tab1). </p><p>  圖1 - 圖2  略

16、 </p><p><b>  3 討論 </b></p><p>  VEGF是近年發(fā)現的可以特異性作用于血管內皮細胞(EC)的生長因子.體外實驗證明VEGF可以直接促進EC的增殖,還可以通過提高已有血管的通透性,使血漿蛋白滲入基質,利于EC的移行,間接促進血管生成[4] .β3整合素屬粘附分子家族成員,可與αIIb或αV亞基結合,其中αVβ3分子在血管生成中的作用

17、備受關注,表達于細胞膜表面,識別細胞外基質的RGD序列,對于EC的移行有重要意義[5] .本實驗表明,正常皮下組織中沒有血管生成的存在,VEGF及β3整合素mRNA的表達很低;在肉芽組織增殖期,HE切片證明EC在局部聚集成團,胞質增多,增殖明顯,增殖的EC借助與細胞外基質的結合移行形成大量新生血管芽,此時VEGF及β3整合素水平明顯增高,待肉芽組織完全成熟后,新生血管逐漸成熟退化,二者的表達也隨之下降,表明VEGF及β3整合素可能是血管

18、生成重要的始動分子,對于維持血管生成也有重要作用;同時也提示它們可以作為臨床血管生成治療的“靶分子”.VEGF及β3整合素受控表達的機制尚不清楚,缺氧及某些炎癥因子可能參與其中的調節(jié)[6,7] . </p><p>  表1 不同組織中VEGF及β3整合素mRNA表達水平的定量分析結果 略 </p><p>  RT-PCR適于用Northern blot檢測不到的低豐度RNA.實驗證明,

19、同一循環(huán)體系下,模板量在一定濃度范圍內時,PCR產物條帶強度與模板量成比例關系;當循環(huán)次數處于PCR擴增的對數增長期時,PCR產物的熒光強度同模板量亦成比例關系[8] ,因此用RT-PCR定量分析mRNA的關鍵是嚴格優(yōu)化實驗條件,如模板量及循環(huán)次數的控制等,本實驗重復幾次結果一致. </p><p><b>  參考文獻: </b></p><p> ?。?]Fol

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