吸收光譜法及熒光分析法

1、吸收光譜法及熒光分析法,主講：易有榮,吸收光譜法,吸收光譜法是根據(jù)物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)的光具有選擇性吸收而建立起來的一種分析方法。它既可對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性分析也可定量測(cè)定物質(zhì)含量。包括紫外、可見光及紅外吸收光譜等。如果在測(cè)定時(shí)利用單色器獲得的單色光來測(cè)定物質(zhì)對(duì)光的吸收能力，則稱為分光光度法。 人眼能產(chǎn)生顏色的光區(qū)稱可見光區(qū)，其波長(zhǎng)范圍為380-760nm。近紫外光區(qū)的波長(zhǎng)范圍為200-380nm。,,吸收光譜法,紫外-可見光光分光光度法是

2、根據(jù)物質(zhì)分子對(duì)200-760nm光區(qū)的吸收特性而進(jìn)行分析的方法，其特點(diǎn)是： 1)靈敏度高，能測(cè)定生物試樣中的微量物質(zhì)。 2）選擇性強(qiáng)，由于組分的分子結(jié)構(gòu)不同，它們的吸收光譜不同，因此只要選擇適當(dāng)?shù)姆蛛x步驟和實(shí)驗(yàn)條件，就可以進(jìn)行生物試樣中的單組分和多組分的測(cè)定。 3 ) 精密度和準(zhǔn)確度較高。 4 )儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，操作易掌握。定性能力較弱，通常還需與紅外、色譜、質(zhì)譜等技術(shù)結(jié)合才能作出可靠的定

3、性鑒定。,,物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收,太陽(yáng)或白火只燈（鎢燈）發(fā)出的可見光，是一種由許多不同波長(zhǎng)的光所組成的寬廣光譜，若將它通過三棱鏡分光，則可看到紅、橙、黃、綠、青、藍(lán)、紫等顏色?？梢姡坠馐腔旌瞎?，它是由多種不同波長(zhǎng)范圍的單色光按一定比例混合而成的。如果把兩種適當(dāng)顏色的光按一定比例混合也可得到白光，則這兩種顏色互稱為互補(bǔ)色。物質(zhì)對(duì)光具有選擇性吸收的能力。同一物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)光的吸收能力不同，不同物質(zhì)對(duì)同一波長(zhǎng)光的吸收能力也不同。物質(zhì)所呈現(xiàn)

4、的顏色正是由于它對(duì)光的選擇性吸收而產(chǎn)生的。,,物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收,當(dāng)一束光照射到某一物質(zhì)的溶液時(shí)，若該溶液對(duì)可見光譜中各種顏色的光都不吸收則溶液呈透明無(wú)色狀；若幾乎全部吸收則溶液呈黑色；若對(duì)各種顏色的光都能均勻吸收一部分則溶液呈灰色。若溶液對(duì)其中某些波長(zhǎng)的光吸收較多，透過較 少；而對(duì)另一些波長(zhǎng)的光吸收較少，透過較多，則溶液就呈現(xiàn)這種吸收較少透過較多的光的顏色，即溶液的顏色是它所吸收色光的互補(bǔ)色。 例如；KMNO4的水溶液選擇性

5、吸收可見光中的大部分黃綠色光，故呈紫色； 硫酸銅溶液選擇性吸收黃光而呈藍(lán)色。,,物質(zhì)顏色與吸收光顏色、波長(zhǎng)的關(guān)系,物質(zhì)顏色 吸收光顏色 吸收光波長(zhǎng)（nm） 黃綠 紫色 400－450 黃色 藍(lán)色 450－480 橙色 綠色 480－490

6、 紅色 藍(lán)綠色 490－500 紫紅色 綠色 500－560 紫色 黃綠 560－580 藍(lán)色 黃色 580－600 藍(lán)綠色 橙色 600－650 藍(lán)綠色

7、 紅色 650－750,,吸收光譜,如果測(cè)量某種物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)光的吸收程度，以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)作圖，則可得到一條曲線，稱為吸收曲線，也稱可見－紫外吸收光譜，它能清楚地描述物質(zhì)對(duì)光的吸收情況。由于有機(jī)化合物發(fā)色團(tuán)和助色團(tuán)的種類、數(shù)目及其在分子中所處的位置和環(huán)境不同，因此測(cè)到的吸收光譜不相同。依據(jù)物質(zhì)吸收光譜的形狀和特征可作該物質(zhì)的鑒別、純度檢查和初步結(jié)構(gòu)分析。,,光吸收的基本定律； 朗伯－比爾定律

8、,紫外-可見光吸收光譜的最主要用途是定量分析，即通過吸收光譜選擇一個(gè)或幾個(gè)測(cè)定波長(zhǎng)，測(cè)定試樣中一個(gè)或幾個(gè)組分的含量。紫外-可見光吸收光譜定量分析的基礎(chǔ)是朗伯－比爾定律。它說明了吸光物質(zhì)對(duì)單色光吸收的程度與該物質(zhì)的濃度與厚度之間的關(guān)系，是吸收光譜的基本定律。 當(dāng)單色光通過厚度一定、均勻的吸收溶液時(shí)，該溶液對(duì)光的吸收程度與溶液中物質(zhì)的濃度C成正比，即A=KBC,,光吸收的基本定律； 朗伯－比爾定律,K為吸光系數(shù)，B為溶液的厚度，C為吸光

9、物質(zhì)的濃度K與物質(zhì)的性質(zhì)、溫度、入射光的波長(zhǎng)等有關(guān)。上式的物理意義為；當(dāng)一束平行的單色光通過均勻透明溶液時(shí)，該溶液對(duì)光的吸收程度與溶液中物質(zhì)的濃度和光通過液層厚度的乘積成正比。,,吸收光譜的應(yīng)用,只要被測(cè)物質(zhì)在紫外－可見－近紅外波段由吸收光譜，就可用光譜分析法來定性和定量分析。 1） 定性分析；比較光譜的一致性，與其它方法結(jié)合進(jìn)行分析。 2）定量分析；,,標(biāo)準(zhǔn)曲線法,配制與被測(cè)組分相同的一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在與被測(cè)組分相

10、同的最大吸收波長(zhǎng)下，測(cè)定各標(biāo)準(zhǔn)溶液的A值。以A值為縱坐標(biāo)，以濃度C為橫坐標(biāo),繪出濃度－吸光度關(guān)系曲線，就是標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣品溶液在相同條件下測(cè)定A值，在縱坐標(biāo)上找出與A值相對(duì)應(yīng)的濃度即為樣品的濃度。,,標(biāo)準(zhǔn)曲線法,理想的標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)該是；不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液所測(cè)得的吸光度對(duì)濃度作圖時(shí)，是一條斜率接近于1且通過原點(diǎn)的直線。標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度范圍應(yīng)在被測(cè)物質(zhì)濃度的一半到兩倍之間。吸光度在0、05－1、0之間。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線至少應(yīng)由五個(gè)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)由兩

11、個(gè)以上的重復(fù)值，曲線不能任意延長(zhǎng)。,,利用標(biāo)準(zhǔn)管計(jì)算測(cè)定物含量；,將標(biāo)準(zhǔn)與樣品分別在相同條件下顯色，測(cè)定其吸光度，因是相同物質(zhì)在相同條件下測(cè)定，故可按下式計(jì)算樣品的濃度；A樣/A標(biāo)＝KC樣L/KC標(biāo)L A樣/A標(biāo)＝C樣 /C標(biāo)此法適和A-C線性關(guān)系良好且通過原點(diǎn)的情況。,,紫外分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu),光源單色器吸收池檢測(cè)器信號(hào)顯示系統(tǒng),,紫外分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)—光源,必須具有

12、穩(wěn)定的、有足夠強(qiáng)度的連續(xù)光譜，并經(jīng)聚光鏡使之成為平行光。普通白熾燈（鎢燈）可用以提供可見光光源，其光譜范圍為320－2500nm氫弧燈（氫燈）的常用燈為低壓氫燈，具有石英窗，能提供紫外光，光譜為180－375nm,但實(shí)際應(yīng)用于360nm下。,,紫外分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)—單色器,它是分光計(jì)的心臟部分，是一種將來自于光源的混合光分解為單色光，并能任意改變波長(zhǎng)的裝置，包括分光系統(tǒng)、光路狹縫、波長(zhǎng)調(diào)節(jié)器等部件。分光系統(tǒng)－有棱鏡和光柵兩種，使

13、光源色散產(chǎn)生寬廣光譜。,,紫外分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)—單色器,a、棱鏡：有玻璃和石英制成，b、光柵：在石英或玻璃上刻上許多等距離的平行線（一般每毫米上千條），通過光的“干涉”而分成光譜。c、狹縫：分入光狹縫和出光狹縫。一般兩者寬度一致。狹縫愈窄，光束波愈純。狹縫寬度常以毫米表示。d、波長(zhǎng)調(diào)節(jié)器：一般是調(diào)節(jié)準(zhǔn)直鏡位置以選擇分光光譜的波長(zhǎng)。,,紫外分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)—吸收池,比色杯有不同規(guī)格和形狀，玻璃比色杯用于可見光光度測(cè)定，石英比

14、色杯用于紫外分光光度測(cè)定也可用于可見光。吸收池僅有兩面透光具有光學(xué)性質(zhì);另兩面以磨沙玻璃為材料以示區(qū)別，比色杯的光學(xué)表面不能有任何污染。每次使用完畢，立即到空然后用水清洗3－4次最后可用甲醇沖洗;用蘸有洗滌劑的海綿清洗效果較好。如果以上步驟無(wú)效時(shí)，可將比色杯在50％硝酸中短時(shí)浸泡，再用水充分沖洗。,,紫外分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)—檢測(cè)器,其主要作用是接受透射光信號(hào)變成電能，必要時(shí)加以放大。有三種類型；光電池、光電管、光電倍增管,,紫外

15、分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu),信號(hào)顯示系統(tǒng)：,,Lambda25型紫外主要功能及應(yīng)用范圍,Lambda25型紫分光光度計(jì) 主要功能及應(yīng)用范圍,能定性定量測(cè)定所有再190n-1100nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)有吸收的化合物。1）  波長(zhǎng)掃描功能：用于定性分析。2）波長(zhǎng)編程功能：可同時(shí)測(cè)量2-8個(gè)波長(zhǎng)點(diǎn)的OD值。3）  時(shí)間掃描功能：用于動(dòng)力學(xué)研究。 4)濃度測(cè)定功能：用于定量分析。,,紫外吸收法測(cè)定核酸含量,原

16、理：核苷、核苷酸、核酸的組成成分中都含有嘌呤、嘧啶堿基，這些堿基都具有共軛雙鍵（－C=C-C=C-），能強(qiáng)烈吸收250－290nm的紫外光，其最大吸收在260nm左右。,,紫外吸收法測(cè)定核酸含量,在定性鑒定各類核苷酸物質(zhì)時(shí)，先測(cè)定它們?cè)趲讉€(gè)特定波長(zhǎng)的紫外吸收值，然后根據(jù)A250/A260、A280/A260、A290/A260比值，來判定是哪一種核苷酸。在定量測(cè)定時(shí)，可根據(jù)在特定波長(zhǎng)（一般在260nm）的紫外吸收值計(jì)算含量。,,紫外吸收

17、法測(cè)定核酸含量,另外旦白質(zhì)液具有紫外吸收，其吸收高峰在280nm處，在260nm處吸收值僅為核酸的1/10或更低。因此對(duì)于含有微量蛋白質(zhì)的核酸樣品測(cè)定誤差小，根據(jù)核酸在260nm和280nm吸收比值可判定核酸的純度，,,紫外吸收法測(cè)定核酸含量,RNA的純度A260/A280應(yīng)該為2以上，若小于2表示可能有蛋白質(zhì)污染DNA的純度A260/A280應(yīng)該為1.8,若小于1.8表示可能有蛋白質(zhì)或酚污染；大于1.8表示可能有RNA污染。,,紫外

18、吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量,原理：由于蛋白質(zhì)中駱氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此蛋白質(zhì)具有紫外吸收特性，吸收峰在280nm處，在此波長(zhǎng)時(shí)，蛋白質(zhì)溶液的吸光度A280與其含量成正比關(guān)系，可用作定量測(cè)定。,,紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量,由于核酸在280nm也有吸收，對(duì)蛋白質(zhì)測(cè)定有干擾作用，但核酸的最大吸收峰在260nm若同時(shí)測(cè)定260nm的光吸收，則通過計(jì)算可消除核酸對(duì)蛋白質(zhì)的影響。,,紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量,其缺點(diǎn)是當(dāng)待測(cè)蛋白質(zhì)

19、與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中的駱氨酸和色氨酸殘基含量差異較大時(shí)會(huì)產(chǎn)生一定的誤差，不同的蛋白質(zhì)和核酸的紫外吸收是不同的，即使經(jīng)過校正，測(cè)定結(jié)果還存在一定誤差。因此紫外吸收法僅作為初步定量依據(jù)。蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）=1.45A280-0.74A260蛋白質(zhì)濃度（mg/ml0=1.55A280-0.76A260,,GENios多功能酶標(biāo)儀主要功能,集多種檢測(cè)于一體 光吸收（Absorbance）-紫外及可見光（230－1000

20、nm） 紫外可見熒光測(cè)定（230－700nm） 生物連續(xù)發(fā)光測(cè)定、化學(xué)連續(xù)發(fā)光測(cè)定兼容多種樣品模式 6－1536微孔板、PCR管、比色杯頂部與底部閱讀，貼壁細(xì)胞和帶蓋樣品選用底部讀數(shù) 結(jié)果更準(zhǔn)確多達(dá)32塊濾光片的光路設(shè)計(jì)廣泛地用途 DNA、RNA、旦白質(zhì)光吸收和熒光定量 ELISA及熒光ELISA實(shí)驗(yàn)、報(bào)告基

21、因?qū)嶒?yàn)（Luciferase）、細(xì)胞學(xué)相關(guān)研究等,,Magellan包含6種主要向?qū)ь愋?酶標(biāo)儀的操作軟件Magellan包含6種主要向?qū)ь愋?；并由向?qū)б龑?dǎo)操作者自動(dòng)完成儀器操作。其向?qū)ь愋陀桑韩@得原始數(shù)據(jù)：通過設(shè)置參數(shù)和啟動(dòng)測(cè)量快捷得到原始數(shù)據(jù)。運(yùn)行一個(gè)方法；根據(jù)已定義的方法操作儀器。結(jié)果求值：可查看原始數(shù)據(jù)并獲得原始數(shù)據(jù)和運(yùn)行一個(gè)方法獲得結(jié)果求值。創(chuàng)建/編輯一個(gè)方法；定義和編輯一個(gè)方法該方法包含必要的測(cè)量參數(shù)、結(jié)果求

22、值、數(shù)據(jù)處理。創(chuàng)建/編輯樣本ID列表：雜項(xiàng)：,,熒光分析法,熒光分析法,基本原理    某些物質(zhì)的分子能吸收能量而發(fā)射出熒光，根據(jù)熒光的光譜和熒光強(qiáng)度，對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性或定量的方法，稱為熒光分析法（fluorescence analysis）。    熒光分析法具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、需樣量少和方法簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，它的測(cè)定下限通常比分光光度法低2~4個(gè)數(shù)量級(jí)。,,熒光分析法,

23、熒光分析法的應(yīng)用范圍熒光分析在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、生物醫(yī)學(xué)、藥物血濃、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品分析應(yīng)用較多。主要用于胺類如組織胺、多巴胺，甾族化合物、DNA、RNA、酶、輔酶、青霉素、連霉素維生素、強(qiáng)心甙、麻醉劑。,,熒光分析法,熒光分析法是測(cè)定物質(zhì)吸收了一定頻率的光以后，物質(zhì)本身所發(fā)射的光的強(qiáng)度。物質(zhì)吸收的光，稱為激發(fā)光；物質(zhì)受激后所發(fā)射的光，稱為發(fā)射光或熒光。如果將激發(fā)光用單色器分光后，連續(xù)測(cè)定相應(yīng)的熒光的強(qiáng)度所得到的曲線，稱為該熒光物質(zhì)的激發(fā)光

24、譜（excitation spectrum）。,,熒光分析法,實(shí)際上熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜就是它的吸收光譜。在激發(fā)光譜中最大吸收處的波長(zhǎng)處，固定波長(zhǎng)和強(qiáng)度，檢測(cè)物質(zhì)所發(fā)射的熒光的波長(zhǎng)和強(qiáng)度，所得到的曲線稱為該物質(zhì)的熒光發(fā)射光譜，簡(jiǎn)稱熒光光譜（fluorescence spectrum）。在建立熒光分析法時(shí)，需根據(jù)熒光光譜來選擇適當(dāng)?shù)臏y(cè)定波長(zhǎng)。激發(fā)光譜和熒光光譜是熒光物質(zhì)定性的依據(jù)。,,熒光分析法,對(duì)于某一熒光物質(zhì)的稀溶液，在一定波長(zhǎng)和一定強(qiáng)

25、度的入射光照射下，當(dāng)液層的厚度不變時(shí)，所發(fā)生的熒光強(qiáng)度和該溶液的濃度成正比，這是熒光定量分析的基礎(chǔ)。熒光物質(zhì)的線性范圍一般在0.00005-100微克/ml,當(dāng)熒光物質(zhì)溶液的吸光度小于或等于0.05時(shí)熒光強(qiáng)度和濃度才成線性關(guān)系。當(dāng)高濃度時(shí)，由于自粹滅和自吸收使熒光強(qiáng)度和濃度不呈線性關(guān)系，發(fā)生負(fù)偏差。因此分析時(shí)注意在校正曲線的線性范圍內(nèi)進(jìn)行。,,熒光分析法,熒光儀的主要部件    測(cè)定熒光可用熒光計(jì)和熒光

26、分光光度計(jì)，二者的結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度不同，但其基本結(jié)構(gòu)是相似的。由光源發(fā)出的光，經(jīng)單色器讓特征波長(zhǎng)的激發(fā)光通過，照射到液槽使熒光物質(zhì)發(fā)射出熒光，經(jīng)第二個(gè)單色器讓待測(cè)物質(zhì)所產(chǎn)生的特征波長(zhǎng)熒光通過，照射到檢測(cè)器產(chǎn)生光電流，經(jīng)放大后以指針指示或用記錄儀記錄其信號(hào)。,,熒光分析法,儀器的主要部件如下：光源：發(fā)射紫外區(qū)和可見區(qū)的激發(fā)光，一般常用的為溴鎢燈和汞蒸汽燈，以及氙弧燈。單色器：儀器共有兩個(gè)單色器，作用分別是濾去非特征波長(zhǎng)的激發(fā)光，和濾去非特

27、征波長(zhǎng)熒光的雜散光。液槽：用來盛放待測(cè)溶液。檢測(cè)器：檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)所發(fā)射的熒光信號(hào)。,,熒光分析法,熒光分析法的定性和定量（一）定性分析    熒光物質(zhì)特性的光譜包括激發(fā)光譜和熒光光譜兩種。在分光光度法中，被測(cè)物質(zhì)只有一種特征的吸收光譜，而熒光分析法能測(cè)出兩種特征光譜，因此，鑒定物質(zhì)的可靠性較強(qiáng)。當(dāng)然，必須在標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照下進(jìn)行定性。,,熒光分析法,（二）定量測(cè)定    熒

28、光分析法的定量測(cè)定方法較多，可分為直接測(cè)定法和間接測(cè)定法兩類。直接測(cè)定法： 利用熒光分析法對(duì)被分析物質(zhì)進(jìn)行濃度測(cè)定，最簡(jiǎn)單的便是直接測(cè)定法。某些物質(zhì)只要本身能發(fā)熒光，只須將含這類物質(zhì)的樣品作適當(dāng)?shù)那疤幚砘蚍蛛x除去干擾物質(zhì)，即可通過測(cè)量它的熒光強(qiáng)度來測(cè)定其濃度。具體方法有兩種。,,熒光分析法,直接比較法： 配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度Fx，已知標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度Cs，便可求得樣品中待測(cè)熒光物質(zhì)的含量。 如果空白溶液的熒光強(qiáng)度

29、調(diào)不到零，則必須從Fs和Fx值中扣除空白溶液的熒光強(qiáng)度F0，然后進(jìn)行計(jì)算。,,熒光分析法,標(biāo)準(zhǔn)曲線法： 將已知含量的標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)過和樣品同樣處理后，配成一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定其熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度對(duì)熒光物質(zhì)含量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再測(cè)定樣品溶液的熒光強(qiáng)度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線便可求出樣品中待測(cè)熒光物質(zhì)的含量。,,熒光分析法,間接測(cè)定法：有許多物質(zhì)，它們本身不能發(fā)熒光，或者熒光量子產(chǎn)率很低，僅能顯現(xiàn)非常微弱的熒光，無(wú)法直接測(cè)定，這時(shí)可采用間接測(cè)定方法。

30、,,熒光分析法,間接測(cè)定方法有以下幾種：（1）化學(xué)轉(zhuǎn)化法：通過化學(xué)反應(yīng)將非熒光物質(zhì)變?yōu)檫m合于測(cè)定的熒光物質(zhì)。例如金屬與螯合劑反應(yīng)生成具有熒光的螯合物。有機(jī)化合物可通過光化學(xué)反應(yīng)、降解、氧化還原、偶聯(lián)、縮合或酶促反應(yīng)，使它們轉(zhuǎn)化為熒光物質(zhì)。（2）熒光猝滅法：這種方法是利用本身不發(fā)熒光的被分析物質(zhì)能使某種熒光化合物的熒光猝滅的性質(zhì)，通過測(cè)量熒光化合物熒光強(qiáng)度的下降，間接地測(cè)定該物質(zhì)的濃度。,,熒光分析法,減小測(cè)量誤差的方法（1）溶劑：

31、溶劑能影響熒光效率，改變熒光強(qiáng)度，因此，在測(cè)定時(shí)必須用同一溶劑。（2）濃度：在較濃的溶液中，熒光強(qiáng)度并不隨溶液濃度呈正比增長(zhǎng)。因此，必須找出與熒光強(qiáng)度呈線性的濃度范圍。（3）酸度：熒光光譜和熒光效率常與溶液的酸度有關(guān)，因此，須通過條件試驗(yàn)，確定最適宜的pH值范圍。,,熒光分析法,（4）溫度：熒光強(qiáng)度一般隨溫度降低而提高，因此，有些熒光儀的液槽配有低溫裝置，使熒光強(qiáng)度增大，以提高測(cè)定的靈敏度。在高級(jí)的熒光儀中，液槽四周有冷凝水并附有恒