液相色譜儀實用技術(shù)

1、第六章液相色譜儀實用技術(shù)--分析常見問題--儀器日常維護(hù)--儀器常見 故障--色譜柱的使用與保養(yǎng),,分析常見問題,,,基線噪音,可能的原因： ﹠流動池臟 ﹠檢測器燈有問題 ﹠如果是周期性的，電壓或泵的脈沖 ﹠溫度對檢測器的影響 ﹠氣泡經(jīng)過檢測器,基線漂移,可能的原因：﹠梯度洗脫﹠溫度不穩(wěn)定 (示差檢測器）﹠ 流動相中有污染物﹠柱中的流動相沒有平衡﹠體系中有污染物流出,鬼 峰,問題1- 流動相臟問題2- 容

2、器污染問題3- 柱子污染,,20% - 100% MeOH,沒有進(jìn)樣,,3,7,15,17,,,,,,,,,,,鬼峰——即使不進(jìn)樣也會出現(xiàn)的峰,峰 型,可能原因：﹠柱中有死體積﹠過濾片部分堵塞﹠只有一個雙峰——組分的共洗脫﹠樣品與溶劑不匹配，溶劑與柱子不匹配,雙 峰,柱 塌 陷,,,,可能原因：,,,,峰 型,可能的原因：部分峰拖尾﹠二次保留效應(yīng)——殘留硅醇基的反應(yīng)﹠小峰緊跟在大峰的后面流出所有峰拖尾﹠額

3、外的柱效應(yīng)﹠柱壞/不適當(dāng)?shù)娜軇┅}柱頭有污染﹠金屬﹠不適當(dāng)?shù)臉悠妨?峰 型,可能的原因﹠在大峰前，有小峰流出﹠柱死體積﹠樣品溶劑不適當(dāng)﹠過濾片部分堵塞﹠柱過載,峰 型,原因﹠樣品的吸收比流動相的吸收值低﹠當(dāng)樣品組分通過色譜柱時打破了原來的平衡﹠用示差檢測器時是正常的,,峰寬,* 在進(jìn)樣口到柱或柱到檢測器之間，使用細(xì)的短的連接管* 保證所有的管路接頭都使用正確* 用小體積檢測池* 減少進(jìn)樣量或降低樣品

4、濃度,,柱外體積增加,,柱外體積效應(yīng)的影響,,壓力,I. 不進(jìn)樣時柱壓連續(xù)升高- 泵密封墊- 流動相有顆粒- 流動相溶解性- 流動相的不穩(wěn)定性 (聚合)- 形成柱死體積 (與使用條件有關(guān))II. 進(jìn)樣時壓力升高- 樣品有顆粒樣品在流動相中不溶進(jìn)樣閥堵塞- 樣品組分與固定相不兼容,保留值漂移,I. 所有峰都向低保留值方向漂移（酸、堿、中性化合物）- 鍵合相流失- 流動相不穩(wěn)定 (可能性較小)- 溶劑輸送系統(tǒng)

5、(流速變化)II.所有峰都向高保留值方向漂移- 在水/有機(jī)溶劑的混合體系中，有機(jī)溶劑含量減少- 柱改變 (可能性較小)- 溶劑輸送系統(tǒng) (流速變化)III.離子型化合物的色譜峰的保留值漂移-流動相中揮發(fā)性組分損失 (離子強度, pH 漂移)- 柱改變 (鍵合相或污染),保留值漂移,I. 與流動相有關(guān)的問題- 使用新鮮的流動相?pH?電導(dǎo)?色譜性能測試II. 與色譜柱有關(guān)的問題- 測試新柱- 用

6、標(biāo)準(zhǔn)的測試混合樣測試新柱- “清洗” 色譜柱后再測- 考慮樣品基質(zhì)與使用條件對柱穩(wěn)定性的影響,液相色譜儀的日常維護(hù),,,儲液罐? 使用HPLC試劑/溶劑? 含緩沖鹽的流動相過0.25μm膜除去微粒物質(zhì)? 更換流動相時,應(yīng)徹底清洗，防止交叉污染。? 定期清潔儲液器及附件，防止長微生物,輸液泵,? 流動相要過濾、脫氣? 密封墊易損壞引起故障,輸液泵,?每天實驗結(jié)束一定要認(rèn)真沖洗泵,注意防止堵塞 ﹠ 使用緩沖鹽流動相時,更要

7、小心。?注意泵壓力不要太高 ﹠要適當(dāng)調(diào)整壓力,一般壓力上限在10-20MPa，下限為0.5MPa， ﹠防止因泵堵塞造成壓力過高損壞柱塞桿或燒壞電機(jī),檢測器（流動池）,? 保持清潔，每天用后與色譜柱一起清洗? 不定期用強溶劑反向沖洗檢測器? 使用脫過氣的流動相，防止氣泡滯留池內(nèi)? 檢測器燈有一定壽命，平衡和清洗色譜柱時不要開燈。,流動池的清洗方法（盡量少用）,?斷開所有的管路，把針泵接到流動池的出口?用10--20ml

8、純水沖洗流動池（要確認(rèn)所用溶劑已洗干凈）?用10--20ml的20%硝酸沖洗流動池（可以適當(dāng)停留30min左右）?用30—40ml左右純水沖洗?用10—20ml左右甲醇沖洗?用干凈的氣體吹干,進(jìn)樣閥,?清洗 停機(jī)前一定沖洗干凈進(jìn)樣器內(nèi)殘留的樣品或緩沖鹽，防止樣品和無機(jī)鹽沉積造成進(jìn)樣閥轉(zhuǎn)子面磨損或堵塞?注射器必須使用儀器專用進(jìn)樣器—平頭注射器,色譜柱—防止柱性能下降,1、溶劑的化學(xué)腐蝕性不能太強；2、避免顆粒物在柱

9、頭沉降；3、柱壓不能太高，防止沖擊太大；固定相流失4、盡可能使用預(yù)柱5、色譜柱應(yīng)在規(guī)定的pH范圍內(nèi)使用6、每天實驗后清洗色譜柱柱；7、定期再生色譜柱8、長時間不用時要保存好,一定要洗去緩沖鹽, 保存在甲醇或乙腈，將柱兩端擰緊,保持 柱填料濕潤。,記錄器數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),?色譜工作站: 防止網(wǎng)上病毒損壞軟件?記錄儀: 熱敏式打印頭要注意記錄紙的質(zhì)量,開機(jī)前注意檢查走紙部件,不要卡紙.

10、,常見故障及解決方法,,儲液器,?脫氣不充分(噪聲大，出毛刺) 用He脫氣, 真空脫氣, 超聲脫氣, 加熱回餾脫氣,(混合流動相不宜)?流動相供給不暢，泵壓力不穩(wěn) 流動相接近用完 過濾器堵塞（有顆粒，長霉） 流速過高,阻力大,造成空化現(xiàn)象. 解決的辦法是:降低流速;換大孔過濾器加大管路內(nèi)徑;抬高儲液器.,儲液器,?儲液器或流動相被污染 產(chǎn)生有規(guī)則的噪聲； 基線上升，梯度洗脫出鬼峰；

11、?原因: ?溶劑質(zhì)量差（含雜質(zhì)多）； ?配流動相的玻璃器皿不合格,微生物影響； ?配制流動相的操作不當(dāng)（過濾、脫氣、攪拌).,輸液泵,?單向閥?球和閥座粘在一起，堵死，打不出溶劑，(緩沖鹽流動相) 用高質(zhì)量的溶劑沖洗，不同極性溶劑沖洗,如水、甲醇、異丙醇、二氯甲烷…，更換新單向閥。,輸液泵,?球和閥座密封不嚴(yán)，壓力不穩(wěn)，氣泡進(jìn)入閥中，緊貼在閥體內(nèi)，使球難以返回閥座，引起倒流，壓力和流速變化大，可能有小晶體顆粒。

12、 清除氣泡的辦法：打開排液閥，大流量沖洗，用脫過氣的甲醇沖洗，一般可解決問題。,輸液泵,?泵墊圈磨損或破碎：高壓下壓力不穩(wěn)，從泵頭往外滲漏流動相，色譜峰的保留時間會改變。 解決辦法：更換新墊圈。更換方法按維修說明書上的方法一步步操作。注意： 輸液泵的墊圈要和流動相匹配協(xié)調(diào)。多數(shù)墊圈和流動相是協(xié)調(diào)的,但有的墊圈適用于甲醇、水、乙腈，在四氫呋喃中溶解、變粘、變軟。 一般應(yīng)學(xué)會換密封墊圈。,輸液泵,?柱塞桿

13、故障 磨損、漏液 使用不當(dāng)被折斷 柱塞桿被卡住，不能運動?更換新柱塞桿 請維修工程師幫助解決，或參照專門的操作手冊自己動手更換,進(jìn)樣系統(tǒng)手動進(jìn)樣系統(tǒng)器,?滲漏 轉(zhuǎn)子密封墊圈松緊不合適； 墊圈不配套； 組裝不對。?堵塞, 樣品打不進(jìn)去。 樣品管堵塞：環(huán)管用反沖法或超聲清洗排除（或換新管).,進(jìn)樣系統(tǒng)手動進(jìn)樣系統(tǒng)器,?注樣孔 ?裝樣時針頭周圍滲漏： 孔道堵塞，或者放空

14、管和樣品管太細(xì)，阻力太大 針頭密封管規(guī)格不對，針頭太細(xì) ?注射孔滲漏： 放空管有虹吸現(xiàn)象，為防止虹吸,放空管末端應(yīng)在放空瓶液面以上, 轉(zhuǎn)子密封面上孔之間有磨損，更換磨損的轉(zhuǎn)子. ?樣品滯留,進(jìn)樣系統(tǒng)手動進(jìn)樣系統(tǒng)器,?閥在進(jìn)樣位置停留時間不夠 ?要求停留時間至少應(yīng)讓流動相流過的體積是環(huán)體積的10-20倍。 (一般是在下一針進(jìn)樣前才將閥扳到裝樣位置)?殘留樣品留在樣品環(huán)中或注射器中，或從放空管

15、中虹吸回來,污染下一個樣品 可用5-10倍的流動相或新樣品沖洗注射孔和注射器,若是虹吸,應(yīng)加限制管。?管路接頭有死體積滯留樣品，很難沖洗干凈 應(yīng)檢查裝配情況，確定是否需換新配件,進(jìn)樣系統(tǒng)自動進(jìn)樣系統(tǒng),?樣品瓶不配套 ?瓶小——針彎、折斷 ?瓶大——樣品少，抽不上樣 ?瓶破碎 更換合適的樣品瓶?進(jìn)樣器針頭堵塞（樣品、緩沖鹽、隔墊碎片、針頭本身)， 可用溶劑清洗，金屬絲疏通，或換新針頭,進(jìn)樣系統(tǒng)自

16、動進(jìn)樣系統(tǒng),?注意樣品瓶隔墊，防止污染?樣品滯留：空白溶劑出色譜峰 ?加倍清洗 ?調(diào)整進(jìn)樣順序，從低濃度開始，高濃度放后面 ?在樣品瓶前放清洗液瓶,色譜柱,?塔板數(shù)下降 ?樣品處理不合適，選擇適當(dāng)?shù)臉悠穬艋椒?，選擇合適流動相 ?柱頭塌陷，填裝修補?峰形變壞 ?出現(xiàn)拖尾峰，分叉峰，非高斯峰，與塔板數(shù)下降有關(guān) ?峰形壞保留時間不變，可能是柱堵塞(不銹鋼燒結(jié)片)，或柱頭有空穴,色譜柱,?柱壓突然增大 ? 濾片

17、被流動相或樣品中顆粒堵住 用0．25µm濾膜除去微量雜質(zhì) ? 樣品沉積在柱內(nèi),用能溶解樣品的溶劑沖洗（斷開柱和檢測器的連接） 可正向沖，反向沖 ? 柱內(nèi)硬件有問題：濾片堵塞，換新片或清洗塌陷，用相同填料填充、修補,使用1：1的硝酸溶液超聲清洗5min，再用水、甲醇清洗除去水份,色譜柱,?柱壓突然增大（續(xù)） ? 柱床膨脹 ? 不可逆吸附 ? 細(xì)菌生長,色譜柱,?保留時間改變

18、 ?不同柱保留時間的變化,主要是填料差異造成的 不同牌號柱出峰順序不變，保留時間有小的變化 ?若峰順序變化，保留時間變化較大 考慮換柱或優(yōu)化分離條件 對專門的分析最好用同一批號的柱子,色譜柱,?新柱柱效低   ?柱外死體積大 ?樣品在流動相中溶解不好，影響傳質(zhì)過程 ?方法: a、更換連接管，重新連接色譜柱，降低死體積 b、使用合適的流動相或使用流動相溶解樣品,色譜柱,?舊色譜柱柱效

19、低，分離不好，柱入口床層塌陷 ? 填料被流動相溶蝕而流失方法： ? 用同型填料填補柱效可部分恢復(fù) ?對硅膠質(zhì)填料，流動相PH值在2—7范圍內(nèi)，否則可能被溶蝕,色譜柱,?舊色譜柱柱效低分離不好，有時出現(xiàn)雙峰 柱?柱入口填料被污染變質(zhì) 方法： ? 用強溶劑沖洗 ? 刮除被污染的床層，用同型的填料填補柱效 可部分恢復(fù) ? 污染嚴(yán)重，則廢棄或重新填裝  g,色譜柱,? 新柱接到儀器

20、上后，柱頭漏液 ? 柱接頭與儀器之間連接管的壓環(huán)變形量不夠 用扳手順時針方向擰緊1／4圈直到不漏液為止 新柱接到儀器上后，啟動儀器沒有柱壓降W ?柱放置時間過長柱內(nèi)充裝的液體己揮發(fā)干 繼續(xù)開泵，用流動相將柱內(nèi)氣體置換掉,色譜柱,新柱接到儀器上后，檢測器出口不斷有小氣泡出現(xiàn)。b ? 柱放置時間過長柱內(nèi)充裝的液體己揮發(fā)干 ? 流動相脫氣不徹底特別是MeOH／H20體系由于氫鍵作用很容易出現(xiàn)氣泡。 方法：

21、 ? 繼續(xù)開泵，用流動相將柱內(nèi)氣體置換掉 ? 配好流動相后一定要進(jìn)行脫氣處理,色譜柱,新柱接到儀器上后柱壓降不斷增加，甚至超過儀器的耐壓限 ? 柱入口濾片被固體顆粒堵塞 ? 柱入口濾片被霉菌堵塞方法： ? 更換或清洗柱入口濾片 ? 用0.25µm過濾膜過濾流動相除去微小顆粒物。,色譜柱,進(jìn)樣次數(shù)增加柱壓降逐漸增加  ? 樣品中含有不溶于流動相的微小顆粒物 ? 樣品在流動相中析出

22、微小結(jié)晶方法： ? 用0.25µm過濾膜過濾樣品 ? 推薦使用流動相溶解樣品。,色譜柱,?使用—段時間后，柱效下降，分離不好#> ?柱填料被流動相溶解而流失 ?柱填料被樣品雜質(zhì)污染方法： ? 推薦使用預(yù)柱 ? 如柱床層塌陷，用相同型號填料填補 ? 推薦使用保護(hù)柱或用強溶劑沖洗色譜柱除去污染雜質(zhì),色譜柱,柱使用一段時間后，柱效下降出現(xiàn)雙峰 ? 柱入口床層被污染使柱填料變質(zhì) 用

23、強溶劑沖洗除去雜質(zhì) 柱使用—段時間后，柱效下降，出現(xiàn)峰拖尾 ? 柱入口床層被污染 用強溶劑沖洗20-30ml，若效果不明顯應(yīng)廢棄,色譜柱,? 進(jìn)樣量增大與峰面積增加不成正比，即進(jìn)樣量與峰面積不是線性關(guān)系。,Pl  ? 樣品在流動相中的溶解度小，只有部分樣品被流動相沖入色譜柱中，而另一部分則沉積在柱入口端方法： ? 用流動相溶解樣品 ? 樣品的濃度不宜太大 ? 進(jìn)樣量不宜過大,色譜柱,?

24、 使用緩沖液作流動相時，柱壓降升高很快   ? 霉菌生長所致方法： ? 在流動相中加入有毒物質(zhì)或加疊氯化鈉防止霉菌生長 ? 實驗結(jié)束后按要求用MeOH和水沖洗后關(guān)機(jī),色譜柱,用5µm顆粒填料柱時， 以MeOH／H20作流動相柱壓較高79-M-#   ? MeOH與水之間由于氫鍵作用黏度增大 可用乙腈／水體系使柱壓降低，分離效率更好。 ? 長時間放置的色譜柱，出現(xiàn)雙

25、峰   ?柱床層出現(xiàn)干裂 柱放置時，最好使用相應(yīng)的溶劑充填好，防止受大的機(jī)械震動，如床層干裂應(yīng)廢棄掉,色譜柱,流動相洗滌強度由弱漸強時出現(xiàn)很多雜質(zhì)峰  ?強溶劑將弱溶劑洗不出的雜質(zhì)沖出來，不影響柱的性能? 柱使用一段時間后保留值逐漸縮短。    ?柱中固定相流失所致 方法： ? 更換色譜柱 ? 檢查所用的色譜條件是否合適,色譜柱,? 在U V色

26、譜圖中，靠近死時間處出現(xiàn)負(fù)峰 ? 進(jìn)樣時壓力波動所致 ? 樣品溶液比流動相的UV吸收值低方法： ? 采用閥進(jìn)樣 ? 用流動相溶解樣品,由色譜柱引起的故障,檢測器紫外—可見光檢測器,?燈故障:基線噪聲大,靈敏度低, ? 氘燈壽命:1000h ? 汞燈和鎢燈壽命:2000h 一般使用6個月以上可能接近壽命期限,可以考慮更換新燈,檢測器紫外—可見光檢測器,?流動池 ? 流動池內(nèi)有氣泡

27、 用脫氣甲醇，不同流量沖洗 ? 池堵塞（入口、出口、池內(nèi)） 用可溶堵塞物的溶劑沖洗 （緩沖鹽用水沖洗） ? 池污染 異丙醇、二氯甲烷、 6mol/L HNO3 沖洗,檢測器紫外—可見光檢測器,?測量池和參比池失配 ? UV以空氣為參比，一般不扣流動相本底 ? 若用有紫外吸收的流動相，參比信號不為零，會出現(xiàn)倒峰和偽峰。此時，選擇合適的流動相。,檢測器紫外—可見光檢測器,?時間常數(shù)選擇：（過濾噪聲） 有的儀器有固

28、定的時間常數(shù)，有的需設(shè)置時間常數(shù)。 ?時間常數(shù)太小, 噪聲增大; ?時間常數(shù)太大,出現(xiàn)寬峰、拖尾或矮峰。 時間常數(shù)的設(shè)置一般根據(jù)經(jīng)驗估計，小顆粒柱常數(shù)小，可選最窄峰寬的1/10作為時間常數(shù),對4.6×(150-250)mm，5um柱，可選0.5s or1s,檢測器 非線性響應(yīng),?超出線性范圍 ?樣品量太大 ?檢測器的衰減超出了其線性動力學(xué)范圍 ?流動相的紫外吸收比較強,檢測器 溫度影響,? 環(huán)境溫度變化

29、引起基線漂移 ? 流動相溫度變化引起折射率改變，紫外光傳導(dǎo)變化 ? 柱溫變化引起基線漂移,檢測器信號線故障,?記錄儀和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)信號線插接不緊,接觸不良，信號很弱，出現(xiàn)不需要的噪音,此時按說明書檢查線路連接。?地線對儀器很重要, 儀器外殼和信號線的接地很嚴(yán)格，接地不良會出現(xiàn)較大的基線噪聲，接錯線會造成短路，燒毀儀器。,檢測器 波長問題,?次級發(fā)射效應(yīng)：用氘燈作可見光范圍的光源時會發(fā)生次級發(fā)射效應(yīng)，用鎢燈沒有此影響.?正確選

30、擇波長:既照顧到靈敏度,有考慮到穩(wěn)定性 ?波長校準(zhǔn)：機(jī)械轉(zhuǎn)動光柵選擇波長,因磨損造成所選波長與刻度盤上的不一致，而且重復(fù)性也差?？捎貌ㄩL溶液校準(zhǔn)：235、257、315、350nm 。,色譜柱的使用及保養(yǎng),,色譜柱與儀器的聯(lián)接,?不同公司的色譜柱接頭不同。處理不當(dāng)時,會造成：色譜峰展寬(死體積)致使柱效下降或滲漏解決辦法∶ ? 自制相應(yīng)的轉(zhuǎn)換接頭 ? 使用“通用”型接頭（錐箍及螺母）,這種錐箍在不銹鋼管上是活動的，即

31、stop-depth的長度可調(diào)，能換接不同的色譜系統(tǒng)及色譜柱。如PEEK工程塑料的接頭,色譜柱與儀器的聯(lián)接,?各種錐箍和管路接頭長度示意圖圖:,色譜柱與儀器的聯(lián)接,? Stop_depth長度不合適造成柱前死體積,錐箍,色譜柱與儀器的聯(lián)接,?錐箍錐度不合適造成滲漏:,測柱效-良好的色譜實驗習(xí)慣,? 拿到一根新色譜柱時，先測柱效? 保留在新色譜柱上測得的色譜圖，并記錄? 色譜測試條件? 定期檢測柱效? 定期檢測儀器的譜帶展寬,測柱

32、效的方法,?色譜柱種類繁多,性能各異,測定方法亦各不相同? 各色譜柱均附有說明書,可按說明書所述方法測定 例：Waters反相C18柱的測定方法 ? 流動相:乙腈/水=60:40;流速:1ml/min ? 樣品:50mg Acenaphthene(二氫苊)溶于100ml乙腈, ? 加入600μl丙酮 ? 進(jìn)樣量5μl ? 檢測波長:254nm,計算色譜柱的柱效 N,理論塔板數(shù)計算公

33、式：W σ 方法Wtan 16 切線法Wh 5.54 半峰高W3σ 9 3σW4σ 16 4σW5σ 25 5σ,不好的色譜柱的柱效反而比好色譜柱的要高，因為其拖尾部分測不出來,色譜柱的正確使用及操作,? 流動相的轉(zhuǎn)換? 流

34、速(壓力)的變化幅度? 溫度的變化幅度? 專用色譜柱∶樣品及溶劑的要求 記住∶拿到一根從未用過的色譜柱時一定要先看其使用說明！,正確使用色譜柱（一）,?樣品方面 ?除去微粒及雜質(zhì) ?了解樣品在流動相中的溶解度 ?如樣品的溶劑不是流動相，一定要用流動相試溶解度，防止其在流動相中析出 ?了解樣品與色譜柱的基質(zhì)/填料是否相互作用,正確使用色譜柱（二）,? 流動相方面 ?除去微粒 ?純度的要求 ?超純水，梯度實驗時水中有

35、機(jī)雜質(zhì)含量要低 ?緩沖液的pH值，在填料的允許范圍內(nèi) ?緩沖液（鹽）的濃度 ?溶劑：色譜純，并與填料相匹配 ?溶劑中的雜質(zhì)含量 ?流動相對樣品的溶解度 ? 有機(jī)溶劑或水的比例,色譜柱的在線保護(hù)裝置,?給色譜柱提供物理的保護(hù) ?除去樣品及流動相中的顆粒?給色譜柱提供化學(xué)的保護(hù) ?防止分析柱被化學(xué)污染?裝置 ?在線過濾器 ?自裝填料保護(hù)柱 ?預(yù)裝保護(hù)柱,在線過濾器,?防止

36、顆粒在色譜柱頭累積 ?優(yōu)點：基本不影響柱效 ?在需要高柱效的分析時中常用（如：氨基酸分析）可更換的消耗品 ?更換濾芯 ?更換墊圈,保護(hù)柱,?可避免化學(xué)污染。多數(shù)保護(hù)柱影響到整個色譜柱的柱效，特別是在用微柱時? 保護(hù)柱的種類 ? 普通自裝填料的保護(hù)柱 影響柱效同裝填技術(shù)有關(guān)，柱效降低較大 ? 有各種填料的預(yù)裝柱供選擇，使用方便 填料容積較小，會引起柱效降低,色譜柱的清洗,?對所做的樣品要有充分的了解

37、 ? 用對該樣品洗脫能力最強的流動相清洗?硅膠柱的一般方法 ? 先用甲醇洗去極性雜質(zhì) ? 用干燥的二氯甲烷、正庚烷100~200ml依次活化?鍵合相柱(烷基)的一般方法 ? 20倍柱體積的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次沖洗 記住∶每種色譜柱可能有特定的方法一定 要先看其使用說明！,反相C18色譜柱的清洗,在流動相中添加了一些酸、堿或緩沖鹽后一般的沖洗方法：第一步：用和流動相相同比例的水

38、和有機(jī)相沖洗第二步：增大水的比例到90%~95%（最好用梯度）第三步：增大有機(jī)相比例到100%（最好用梯度） 最后保存在有機(jī)相（甲醇或乙腈）中,色譜柱的存放,?存放前的處理 ?除去雜質(zhì)、緩沖鹽?合適的存放溶劑? 避免色譜柱床的干涸? 避免機(jī)械震動? 防止細(xì)菌生長? 注意存放的溫度,柱效低--柱內(nèi)因素,?色譜柱被污染?過濾片部分堵塞 ? 樣品、流動相或密封墊的細(xì)小顆粒造成的堵塞?色譜柱內(nèi)的死體積 ? 流

39、動相pH值及組成不合適造成固定相流失 ? 流速急劇變化造成固定相物理損壞 ? 機(jī)械震動造成柱床產(chǎn)生裂縫 ? 柱床收縮或干涸,重復(fù)性差、回收率低,?實驗的重復(fù)性差 ? 色譜柱被污染 ? 流動相pH值及組成不合適造成鍵合相流失 ? 樣品溶劑不同或樣品本身不穩(wěn)定? 回收率低，不出峰 ? “不可逆”吸附 ? 固定相過強或流動相過弱 ? 非特異性吸附,柱效低--柱外因素,

40、?系統(tǒng)連接問題：連接不好造成死體積 ? 進(jìn)樣器 ? 檢測器 ? 管路，連接口 ? 保護(hù)柱 ? 在線過濾器堵塞 ?流動相問題：色譜柱未平衡好 ?進(jìn)樣量太大,“柱效”問題，不一定是色譜柱問題！,柱壓高--柱外因素,?系統(tǒng)反壓問題 ? 阻尼器堵塞 ? 進(jìn)樣器堵塞 ? 管路或連接口堵塞 ? 在線過濾器不干凈 ? 保護(hù)柱 ?壓力傳感器不準(zhǔn)確 ?流速是否錯誤?,柱壓過高，不一定是色譜柱問題！

41、,實驗的重復(fù)性差--柱外因素,? 梯度實驗時平衡時間不足? 溫度波動? 流動相組成改變? 樣品溶劑不同? 樣品穩(wěn)定性不好? 方法開發(fā)不好 ? 緩沖液的pH值不合適 ? 緩沖液的緩沖能力不足,簡單的判別方法,? 高的柱反壓是否伴隨著 ? 保留時間變化? ? 峰形變壞? ? 分辨率變壞?? 測量色譜系統(tǒng)的譜帶展寬 ? 典型的分析系統(tǒng)應(yīng)遠(yuǎn)小于 100 微升 ? 如大于此數(shù)應(yīng)檢查儀器系統(tǒng),

42、測量色譜系統(tǒng)的譜帶展寬,?卸下色譜柱，用UNION(兩通)代替之?按測柱效方法，以1/10的樣品濃度進(jìn)樣，大約2~5微升? 用5 sigma方法測4.4%峰高處的峰寬：W? 儀器參數(shù)∶ ? 流速∶1.0 ml/min ? 紙速∶20 cm/min (用記錄儀時，接檢測器10mV檔) ? 檢測器靈敏度∶0.5-1.0AUFS (用記錄儀時) ? 檢測器時間常數(shù)∶小于0.2譜帶展寬（ml）=1000×W（c