β酪啡肽功效學(xué)研究進(jìn)展

1、β-酪啡肽-7功效學(xué)研究進(jìn)展,營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生M150879吳鵬,目錄,一、β-酪啡肽的簡(jiǎn)介（1） 酪啡肽的定義（2） β-酪啡肽的發(fā)現(xiàn)（3） β-酪啡肽的結(jié)構(gòu)特征二、 β-酪啡肽-7的制備（分離、純化、鑒定）三、 β-酪啡肽-7的主要生理功能及研究進(jìn)展四、展望,酪啡肽的定義,酪啡肽又稱酪蛋白嗎啡、酪蛋白阿片肽、外啡肽，是酪蛋白在消化酶作用下釋放的，能被機(jī)體直接吸收，具有多種生物學(xué)功能的乳源生物活性肽之一。是重要的乳源阿片

2、肽。它具有行為調(diào)節(jié)及免疫調(diào)節(jié)作用，能抑制腸道運(yùn)動(dòng)，促進(jìn)胰島素分泌，對(duì)產(chǎn)乳及內(nèi)源性器官發(fā)育生長(zhǎng)因子有協(xié)同作用。 酪蛋白是乳中最重要的成分。乳源生物活性肽是酪蛋白在消化酶作用下釋放的，能被機(jī)體直接吸收，具有多種生物學(xué)功能。其中酪啡肽是最重要的乳源生物活性肽之一。β-酪啡肽-7(beta-asomor-phin-7p）是從牛乳β-酪蛋白的酶解產(chǎn)物中分離出來(lái)的具有阿片活性的七肽物質(zhì)，為β-酪蛋白第60 -66氨基酸殘基片段。,β-酪啡肽

3、的發(fā)現(xiàn),1979年，Brantl等在豚鼠回腸縱肌腸肌中分離到一個(gè)牛乳酪蛋白的酶解產(chǎn)物，其是一個(gè)含有7個(gè)氨基酸殘基的寡肽，命名為β-酪啡肽-7，序列為Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-lle，為牛β-酪蛋白第60-66位氨基酸殘基片段，它具有很高的阿片活性，能夠與u型阿片受體結(jié)合。后來(lái)人們又發(fā)現(xiàn)了β-酪啡肽-4、 β-酪啡肽-5、 β-酪啡肽-6、 β-酪啡肽-8、 β-酪啡肽-11。,β-酪啡肽的發(fā)現(xiàn),β-酪啡肽的結(jié)構(gòu)特征

4、,,牛β-酪啡肽是由牛β-酪蛋白分解產(chǎn)生的含有3-11個(gè)氨基酸的多肽，都是以牛β-酪蛋白的第60位的酪氨酸作為起始氨基酸;人的β-酪啡肽的結(jié)構(gòu)和牛的非常相似，在N端都具有Tyr-Pro-Phe（酪氨、脯、苯丙）的序列。目前科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了多種長(zhǎng)度的β-酪啡肽，其主要包括β-CM-4,β-CM-5 ,β-CM-6,β-CM-7 ,β-CM-8和β-CM-11，研究表明:對(duì)于所有含有不同數(shù)量氨基酸殘基的β-酪啡肽，在N-末端含有相同的氨基酸序列

5、Tyr-Pro-Phe，這對(duì)于保持β一酪啡肽的生物活性是非常重要的。在酶促降解方面β一酪啡肽是非常穩(wěn)定的，其能夠抵抗多種蛋白酶(如胃蛋白酶和胰蛋白酶)的降解，這種特性與其肽鏈中富含脯氨酸有關(guān)。,β-酪啡肽-7的制備,人和動(dòng)物乳被認(rèn)為是最接近完美的食品，酪蛋白是乳中最主要的蛋白，占乳蛋白的80%左右。這些生物活性肽本身以非活性狀態(tài)存在于蛋白質(zhì)氨基酸序列之中，當(dāng)在一定條件受蛋白酶作用下，可形成有活性的生物活性肽。β一酪啡肽-7是從牛乳β-酪

6、蛋白的酶解物中分離出來(lái)的具有阿片活性的一個(gè)七肽物質(zhì)。,β-酪啡肽-7的制備,一、酪蛋白酶解方法：稱取600mg酪蛋白，加雙蒸水溶解，另加少量NaOH助溶;待酪蛋白充分溶解后加少量HC1，定容。稱取胃蛋白酶，使酶與底物濃度之比為1:25;于37℃水浴保溫，實(shí)驗(yàn)組保溫時(shí)間分別作用60min, 90min, 120min, 150min;酶解結(jié)束后加入15%三氯乙酸終止反應(yīng)，取上清，用NaOH調(diào)整pH至7.1。,二、反相高效液相色譜

7、（RP-HPLC）鑒定酪蛋白酶解產(chǎn)物中的β-CM-7方法：1.待測(cè)液的預(yù)處理:取各時(shí)間點(diǎn)酪蛋白酶解液的上清液2m1，經(jīng)0.22um微孔濾膜過(guò)濾，用于RP-HPLC分析。2.用緩沖液平衡層析柱，待運(yùn)行結(jié)果顯示穩(wěn)定的基線時(shí)，分別取各時(shí)間點(diǎn)的20ul酪蛋白酶解上清液手工進(jìn)樣。3.檢測(cè)波長(zhǎng)215nm，流速0.75，線性洗脫運(yùn)行30min。4.將加樣酪蛋白酶解上清液換成β-CM-7標(biāo)準(zhǔn)品，制定標(biāo)準(zhǔn)峰。5.內(nèi)標(biāo)法檢測(cè):在待測(cè)樣品中加入標(biāo)

8、準(zhǔn)β-CM-7溶液，用以增強(qiáng)待測(cè)樣品的分析結(jié)果。,三、葡聚糖凝膠 （Sephadex）G-15凝膠層析分離純化酪蛋白酶解上清液結(jié)果：120min酪蛋白酶解上清液，經(jīng)葡聚糖凝膠G-15層析結(jié)果圖，在215nm消光讀數(shù)，繪制的洗脫曲線。收集不同組分洗脫液，按管號(hào)為6-19, 20-35, 36-50，51-73, 74-89, 90-120加以合并，得到6個(gè)組分。其中第六組分(箭頭所指)中最有可能含有β-CM-7等小分子物質(zhì)。,三、

9、β-酪啡肽-7的主要生理功能及研究進(jìn)展,酪啡肽的主要生理功能：1.對(duì)胃腸道運(yùn)動(dòng)的影響(降低收縮力，抑制葡萄糖吸收等)2.對(duì)免疫功能的影響（促進(jìn)免疫器官發(fā)育等）3.對(duì)生殖內(nèi)分泌的影響（影響動(dòng)物發(fā)情、排卵、性成熟等）4.對(duì)采食的影響（增加高脂飼料采食等）5.鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜作用（作用同嗎啡，鎮(zhèn)靜止痛、誘導(dǎo)睡眠）6.對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的作用（促進(jìn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)）7.其它作用（導(dǎo)致健忘癥，抗焦慮）,研究進(jìn)展,（1）Brantl等發(fā)現(xiàn)

10、β-酪啡肽-7能夠顯著降低豚鼠回腸收縮力（2）談寅飛等體外研究發(fā)現(xiàn)β-酪啡肽-7可促進(jìn)仔豬胃竇分泌胃泌素（3）宗亞峰的研究發(fā)現(xiàn)β-酪啡肽-7能夠抑制小腸對(duì)葡萄糖的吸收（4）凌明亮等還發(fā)現(xiàn)β-酪啡肽-7能夠增加小腸對(duì)D一木糖的吸收能力（5）顧芳等人研究發(fā)現(xiàn)β-酪啡肽-7能夠防止酒精性脂肪肝（6）潘翠玲發(fā)現(xiàn)飼喂β-酪啡肽-7能夠促進(jìn)仔豬免疫器官和組織的發(fā)育（7）皮下注射β-酪啡肽-7能夠引起類似組胺引起的丘疹和炎癥反應(yīng)（8）研

11、究發(fā)現(xiàn)外周注射β-酪啡肽-7能夠刺激大鼠增加高脂飼料的采食（9）印虹等人研究發(fā)現(xiàn)乳源β-酪啡肽-7具有降血糖作用（10）腹腔注射β-酪啡肽-7能夠顯著降低大鼠尾夾疼痛反應(yīng)（11）β-酪啡肽-7及其衍生物也能夠增加?jì)雰核撸?2）Han等研究發(fā)現(xiàn)β-酪啡肽-7能夠減輕糖尿病大鼠心臟的損傷（13）實(shí)驗(yàn)證明給白化的大鼠飼喂β-酪啡肽-7能夠產(chǎn)生抗焦慮的作用,（6）潘翠玲發(fā)現(xiàn)飼喂β-酪啡肽-7能夠促進(jìn)仔豬免疫器官和組織的發(fā)育,一、材料

12、與方法1.飼養(yǎng)動(dòng)物 將來(lái)源于日齡、體質(zhì)量相近的12頭三元雜交仔公豬隨機(jī)分為對(duì)照組和試驗(yàn)組，每天喂料4次，自由飲水，以紅外燈保溫，室內(nèi)溫度25±2℃濕度81% -85%，試驗(yàn)前及試驗(yàn)過(guò)程中疫病防治均按該場(chǎng)的常規(guī)方案進(jìn)行試驗(yàn)組的仔豬于21日齡斷乳，與母豬隔離，飼養(yǎng)在保育室，在飼喂早期斷乳仔豬料的基礎(chǔ)上，每頭每天添喂10umol/ Lβ-酪啡肽-7的溶液20 mL(分2次喂給)，連續(xù)添喂10d，對(duì)照組的仔豬隨母豬飼養(yǎng)在產(chǎn)仔

13、室繼續(xù)吃母乳到28日齡時(shí)斷乳，移入保育室飼養(yǎng)，飼喂與試驗(yàn)組相同的仔豬料，2組均于32日齡捕殺。,2.樣品處理： 收集胃和十二指腸內(nèi)容物，按1:1的比例用生理鹽水將內(nèi)容物稀釋，4℃ 3 000 r/min離心15 min，取上清液測(cè)相關(guān)酶的活性;取2 cm X 2 cm的胃竇、截取十二指腸的中部、空腸前段(空腸的前1/ 3)的中部、回腸的中部各2cm，用生理鹽水沖去內(nèi)容物，置于Bouin氏液固定，常規(guī)石蠟切片(厚度為6 um) ,

14、HE染色，樹膠封片用Olymps顯微鏡觀察并照相。3.檢測(cè)項(xiàng)目 應(yīng)用Image-processing-plus圖象分析系統(tǒng)測(cè)量腸絨毛長(zhǎng)度、絨毛寬度、腺隱窩深度和腸壁肌層厚度。測(cè)定仔豬胃內(nèi)容物的胃蛋白酶總活性，測(cè)定仔豬十二指腸內(nèi)容物的淀粉酶活性、脂肪酶活性、胰蛋白酶總活性。,,4.數(shù)據(jù)處理 采用Excel分析軟件，平均數(shù)值以X平均±S表示，用t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析。,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：,實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：,1.與對(duì)照組

15、相比，試驗(yàn)組的仔豬胃竇粘膜厚度比對(duì)照組增厚61. 98% 。 2.與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組的仔豬十二指腸絨毛長(zhǎng)度比對(duì)照組增長(zhǎng)34.47%，絨毛寬度與對(duì)照組的相近，腸壁肌層的厚度低于對(duì)照組,腸隱窩深度加深，而腸絨毛長(zhǎng)/隱窩深的比值比對(duì)照組的大16. 98%。 3.與對(duì)照組相比，添喂β-酪啡肽-7溶液的仔豬，十二指腸內(nèi)容物胰蛋白酶總活性比對(duì)照組的低24.39%(P> 0.05)，而胃蛋白酶總活性、淀粉酶活性、脂肪酶活性均極顯著低于對(duì)照

16、組。所以說(shuō)β-酪啡肽-7確實(shí)有促進(jìn)斷奶仔豬免疫器官發(fā)育的功能。,返回,（9）印虹等人研究發(fā)現(xiàn)乳源β-酪啡肽-7具有降血糖作用,1.動(dòng)物分組與處理 健康成年SD大鼠16只，自由采食，飲水，預(yù)飼1周后，隨機(jī)分成對(duì)照組和β-CM-7組。分別灌喂生理鹽水(對(duì)照組)、7.5 X 10^(-6) mol/L(β-CM-7組）每天兩次，每次1 mL，間隔12h，連續(xù)灌喂30天。期間每隔5天斷尾采血，動(dòng)態(tài)觀察血中葡萄糖濃度的變化。2.樣品采集

17、及處理 在試驗(yàn)的第30天(禁食12h)，宰殺大鼠，靜脈采血，血液放置1h后，以3000 rpm離心15 min，分離血清并吸取分裝，-20℃保存?zhèn)溆? 取肝臟、右側(cè)腿肌，放入自封袋，-20℃保存; 取出小腸，用冰冷生理鹽水沖洗，翻轉(zhuǎn)小腸后再漂洗，將洗凈的小腸用吸水紙吸干表面的液體，用載玻片輕刮下小腸豁膜，-80℃保存?zhèn)溆谩?3.指標(biāo)測(cè)定（1）血液中葡萄糖濃度測(cè)定 按試劑盒說(shuō)明書氧化酶法測(cè)定血清中葡萄糖濃度。具

18、體取血清10uL，加入1 mL葡萄糖測(cè)定液，37℃水浴15 min后，冷卻，在波長(zhǎng)505 nm處測(cè)定其OD值，根據(jù)計(jì)算公式計(jì)算血糖值。 G =OD測(cè)定管/OD標(biāo)準(zhǔn)管*5.55mmol/L（2）肝糖原、肌糖原含量的測(cè)定 按試劑盒說(shuō)明稱取肝臟、肌肉各80 mg左右，按照體積比1: 3加堿液后沸水煮20min，流水冷卻，加蒸餾水稀釋成1%肝臟，5%肌肉的糖原檢測(cè)液。取檢測(cè)液100uL,顯色液2 mL，置沸水煮5 m

19、in，冷卻，在波長(zhǎng)620 nm處測(cè)OD值，根據(jù)下面計(jì)算肝糖原二測(cè)定管OD值/標(biāo)準(zhǔn)管OD值、標(biāo)準(zhǔn)管含量、樣本測(cè)定前稀釋倍數(shù)(100) *10/1.11肌糖原二測(cè)定管OD值/標(biāo)準(zhǔn)管 OD值x標(biāo)準(zhǔn)管含量x樣本測(cè)定前稀釋倍數(shù)(20) *1011.11,（3）血清中胰島素、胰高血糖素水平的測(cè)定 胰島素測(cè)定:取100uL血清，加入豚抗一Ins.抗體100 uL, 125I- Ins. 100 uL，混勻放置16-18 h，加入Ins，

20、驢抗豚免疫分離劑500uL，充分混勻后，室溫放置15 min, 3500rpm離心15 min，吸棄上清，測(cè)各管沉淀物的放射性計(jì)數(shù)(cpm)。 胰高血糖素檢測(cè):取200uL血清，加入豚抗一Glu.抗體100uL，混勻室溫放置4 h,加入125I- Glu. 100 }.L，混勻放置16-18 h，加入Glu.驢抗豚免疫分離劑500uL，充分混勻后，室溫放置15 min, 3500 rpm離心15 min，吸棄上清，測(cè)各管沉淀

21、物的放射性計(jì)數(shù)(cpm )。（4）參照戴岳方法測(cè)定腸黏膜a-葡萄糖苷酶活性（5）將刮取的腸囊黏膜，按照試劑盒說(shuō)明檢測(cè)其Na-K-ATP酶活力。,（6）小腸上皮黏膜SGLT -1 mRNA表達(dá)分析 提取樣品總RNA→反轉(zhuǎn)錄→設(shè)計(jì)目的基因引物→序列分析→SGLT -1 mRNA的RT- PCR分析（重復(fù)兩次）（7）數(shù)據(jù)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，差異顯著性檢驗(yàn)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因子方差分析(Oneway

22、 ANOVA， LSD )。所有數(shù)值以平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示。,實(shí)驗(yàn)結(jié)果：,結(jié)論：與對(duì)照組相比，灌喂β-CM-7組大鼠血糖水平略低于對(duì)照組，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析在25天時(shí)差異顯著，其余差異不顯著。,實(shí)驗(yàn)結(jié)果：,結(jié)論：灌喂β-CM-7組大鼠肝糖原含量與對(duì)照組比較差異不顯著(p=0.73 );肌糖原含量與對(duì)照組相比，極顯著降低(p=0.001)。即β-CM-7能夠降低肌糖原的含量。,實(shí)驗(yàn)結(jié)果：,結(jié)論：灌喂β-CM-7組大鼠胰島

23、素、胰高血糖素含量與對(duì)照組相比，差異均不顯著。即β-CM-7對(duì)血糖含量的影響不是直接通過(guò)糖相關(guān)激素影響的。,β-CM-7對(duì)大鼠小腸站膜SGLT -1 mRNA表達(dá)的影響(n=8) A為RT-PCR電泳圖,B柱狀圖為SGLT-1與β-actin mRNA（信使）的灰度比分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果,試驗(yàn)結(jié)果提示，β-CM-7可以下調(diào)小腸黏膜SGLT-1 mRNA的表達(dá)。,總結(jié)：,連續(xù)灌喂β-CM-7大鼠血糖濃度較灌喂生理鹽水有降低，但二者之

24、間差異不顯著(p=0.35 ); 肝糖原、胰島素、胰高血糖素、a-葡萄糖普酶活力、Na+-K+-ATP酶活力二組之間均無(wú)明顯差異; 試驗(yàn)組肌糖原含量低于對(duì)照組(p=0.001 ) ; SGLT 1mRNA表達(dá)顯著低于對(duì)照組(p=0.02 )。結(jié)論: β-CM-7具有輔助降血糖作用，其機(jī)制可能是通過(guò)下調(diào)小腸黏膜上皮SGLT- 1 mRNA的表達(dá)，減少腸道葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，并增加肌糖原的消耗。,生物活性肽的研究給動(dòng)物

25、生理生化、營(yíng)養(yǎng)生理學(xué)、生物醫(yī)藥及食品科學(xué)等學(xué)科提供了一個(gè)廣泛的研究領(lǐng)域，有關(guān)酪啡肽的生理生化研究是一個(gè)很有前景的研究領(lǐng)域，但尚需做很多深入、細(xì)致的工作，如參與調(diào)節(jié)酪啡肽吸收利用的因素，酪啡肽具有的其他生理作用及機(jī)制，利用酪啡肽的研究成果轉(zhuǎn)化成臨床藥品或輔助治療的藥劑。 ——摘自印虹老師文章1.制成降血糖、降血脂藥物。（宋曉丹實(shí)驗(yàn)）2.制成精神科藥物——抗焦慮藥。（張偉實(shí)驗(yàn)）3