實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基的配制、消毒與滅菌

1、實(shí)驗(yàn)一 培養(yǎng)基的制備 消毒與滅菌,培養(yǎng)基配制實(shí)驗(yàn)原理,培養(yǎng)基是人工配制的適合微生物生長(zhǎng)繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。人工制備培養(yǎng)基的目的，在于給微生物創(chuàng)造一個(gè)良好的營(yíng)養(yǎng)條件。,培養(yǎng)基配制要素,營(yíng)養(yǎng)：碳源、氮源、能源、生長(zhǎng)因子、水分和無(wú)機(jī)鹽；適宜的酸堿度(pH值)和一定緩沖能力；一定的氧化還原電位；合適的滲透壓。,培養(yǎng)基的分類(lèi),根據(jù)微生物的種類(lèi)和實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡牟煌囵B(yǎng)基分類(lèi)可以按以下方式：

2、按成分的不同分按培養(yǎng)基的物理狀態(tài)分按培養(yǎng)基的用途分,按照培養(yǎng)基的成分來(lái)分,天然培養(yǎng)基:主要成分是復(fù)雜的天然有機(jī)物質(zhì)合成培養(yǎng)基:用化學(xué)成分完全了解的純化合物藥品配制而成的培養(yǎng)基半合成培養(yǎng)基:以天然有機(jī)物作為微生物營(yíng)養(yǎng)來(lái)源的同時(shí)，適當(dāng)補(bǔ)充一些成分已知的化學(xué)藥品所配制的培養(yǎng)基,按照培養(yǎng)基的物理狀態(tài),固體培養(yǎng)基：加入凝固劑，如1.5% ~ 2.0%瓊脂半固體培養(yǎng)基：加入少量凝固劑，如 0.2% ~ 0.7%瓊脂液體培養(yǎng)基：不含任何凝

3、固劑,按照培養(yǎng)基的用途分,基礎(chǔ)培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基（加富培養(yǎng)基）鑒別培養(yǎng)基：含有特定化合物或試劑。某種微生物在這種培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，它所產(chǎn)生的某種代謝產(chǎn)物與這種特定的化合物或試劑能發(fā)生某種明顯的特征性反應(yīng)，根據(jù)這一特征性反應(yīng)可以將某種微生物與他種微生物區(qū)別開(kāi)來(lái)。選擇培養(yǎng)基：利用微生物對(duì)某種化學(xué)物質(zhì)的敏感性不同，在培養(yǎng)基中加入這類(lèi)物質(zhì)，抑制不需要的微生物生長(zhǎng)，而利用所需分離的微生物生長(zhǎng)，從而達(dá)到分離或鑒別某種微生物的目的。,培養(yǎng)基滅菌,配

4、制培養(yǎng)的各類(lèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和容器等含有各種微生物微生物生長(zhǎng)繁殖： 消耗養(yǎng)分 改變培養(yǎng)的酸堿度 產(chǎn)生毒素或者抑制物,牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的制備,應(yīng)用最廣泛的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基，普通培養(yǎng)基,牛肉膏： 3 g蛋白胨： 10 gNaCl：

5、 5 g瓊脂： 15-20 g水： 1000 mLpH： 7.4~7.6,馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）的制備,用來(lái)培養(yǎng)真菌,馬鈴薯：

6、 200 g蔗糖（葡萄糖） 20 g瓊脂： 15-20 g水： 1000 mLpH：

7、 自然,馬鈴薯去皮，切成塊煮沸30分鐘，然后用紗布過(guò)濾；濾液中加入糖和瓊脂，溶化后補(bǔ)足水至1000 mL。,高氏Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基的制備,用來(lái)培養(yǎng)放線菌,可溶性淀粉： 20 gKNO3： 1 gNaCl：

8、 0.5 gK2HPO4·3H2O： 0.5 g MgSO4·7H2O： 0.5 g FeSO4·7H2O： 0.01 g

9、瓊脂： 20 g水： 1000 mLpH： 7.2~7.4,無(wú)氮培養(yǎng)基的制備,用來(lái)培養(yǎng)固氮菌,葡萄糖：

10、 10 gKH2PO4： 0.2 g MgSO4·7H2O： 0.2 g NaCl：

11、 0.2 gCaSO4·2H2O： 0.2 gCaCO3： 5 g瓊脂： 20 g水：

12、 1000 mLpH： 7.0~7.2,豆芽汁培養(yǎng)基的制備,用來(lái)培養(yǎng)酵母菌,黃豆芽： 10 0 g蔗糖（葡萄糖）： 50 g瓊

13、脂： 20 g水： 1000 mLpH： 自然,稱(chēng)取新鮮黃豆芽100 g，放入燒杯中加水煮沸約30 min，用紗布過(guò)濾。濾

14、液中加入糖和瓊脂，溶化后補(bǔ)足水至1000 mL，最后滅菌。,麥?zhǔn)希∕eclary）培養(yǎng)基的制備,用來(lái)培養(yǎng)酵母菌，利于釀酒酵母子囊孢子的形成,葡萄糖： 1 gKCl： 1.8 g酵母浸膏：

15、 2. 5 g 醋酸鈉： 8.2 g 瓊脂： 20 g水： 1000 mLpH：

16、 自然,LB培養(yǎng)基的制備,用來(lái)培養(yǎng)細(xì)菌,蛋白胨： 10 g酵母膏： 5 gNaCl：

17、 10 g瓊脂： 20 g水： 1000 mLpH：

18、 7.0,操作步驟,稱(chēng)量溶化補(bǔ)足水分，調(diào)pH（過(guò)濾）分裝,6. 加塞7. 包扎8. 滅菌9. 擱置斜面10. 無(wú)菌檢查,,稱(chēng)量藥品時(shí)，嚴(yán)防藥品混雜。稱(chēng)完一種藥品后需要將牛角匙洗凈、擦干，再稱(chēng)取另一藥品。瓶蓋也不要蓋錯(cuò)。藥品不要弄錯(cuò)。如：K2HPO4和KH2PO4、水合形式和無(wú)水形式的化合物要注意分辨。,,培養(yǎng)基中多種無(wú)機(jī)鹽可能相互作用而產(chǎn)生沉淀。因此，在混合培養(yǎng)基成分時(shí)，一般是按配方的順序依次溶

19、解各成分，甚至有時(shí)還需要將二種或多種成分分別滅菌，使用時(shí)再按比例混合。對(duì)于微量成分，可先配制成高濃度的儲(chǔ)備液，按比例換算后再加入。瓊脂溶化過(guò)程中，要控制火力并不斷攪拌，以免沸騰溢出或瓊脂糊底燒焦。不可用銅或鐵鍋加熱溶化，以免離子進(jìn)入培養(yǎng)基。,,調(diào)pH值以前，先補(bǔ)足水分。pH值不要調(diào)過(guò)頭，以免回調(diào)影響個(gè)離子濃度。,,固體分裝：不超過(guò)試管高度的1/5；不超過(guò)三角燒瓶容積的一半為宜。分裝過(guò)程中，注意不要使培養(yǎng)基沾在管（瓶）口上以

20、免污染棉塞而引起污染。,,配好培養(yǎng)基后要貼上標(biāo)簽，寫(xiě)清培養(yǎng)基類(lèi)型、組別、配制時(shí)間。,,消毒與滅菌,消毒是一般指采用物理、化學(xué)和生物的方法消除物體的表面病原菌和有害微生物營(yíng)養(yǎng)體的過(guò)程。滅菌則是指采用物理、化學(xué)和生物的方法殺滅一切微生物的營(yíng)養(yǎng)體、芽孢和孢子的過(guò)程。在微生物實(shí)驗(yàn)中，需要進(jìn)行純培養(yǎng)，不能有任何雜菌污染，因此對(duì)所用器材、培養(yǎng)基和工作場(chǎng)所都要進(jìn)行嚴(yán)格的消毒和滅菌。,消毒與滅菌方法,加熱滅菌干熱滅菌濕熱滅菌過(guò)濾除菌輻射滅

21、菌放射線輻照滅菌紫外線滅菌化學(xué)藥品滅菌,,干熱滅菌,干熱滅菌是利用高溫使微生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。干熱滅菌有火焰灼燒滅菌和熱空氣滅菌兩種。,,細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的凝固性與其含水量有關(guān)。在菌體受熱時(shí)，當(dāng)環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)含水量越大，則蛋白蛋凝固就越快，反之凝固緩慢。因此，與濕熱滅菌相比，干熱滅菌所需溫度要高（160～170℃），時(shí)間要長(zhǎng)（1～2h），但干熱滅菌溫度不能超過(guò)180℃，否則，包器皿的紙或棉塞就會(huì)燒焦，甚至引

22、起燃燒。,高壓蒸氣滅菌,高壓蒸氣滅菌是將待滅菌的物品放在一個(gè)密閉的滅菌鍋內(nèi)，通過(guò)加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸汽。待水蒸氣急劇將鍋內(nèi)冷空氣從排氣閥中趨盡，關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱。由于水蒸氣無(wú)法排出，增加了滅菌鍋內(nèi)的壓力，從而使沸點(diǎn)增高，得到高于100℃的溫度。導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌目的。一般培養(yǎng)基在0.1 MPa下，121℃維持15～30 min可達(dá)到徹底滅菌的目的。滅菌的溫度及維持的時(shí)間隨滅菌物品的性質(zhì)和容量等具體情

23、況而有所改變。,在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大。其原因有三：一是濕熱中細(xì)菌菌體吸收水分，蛋白質(zhì)較易凝固，因蛋白質(zhì)含水量增加，所需凝固溫度降低；二是濕熱的穿透力比干熱大；三是濕熱的蒸氣有潛熱存在。 1 g水在100℃時(shí)，由氣態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)時(shí)可放出2.26 kJ(千焦)的熱量。這種潛熱，能迅速提高被滅菌物體的溫度，從而增加滅菌效力。,在使用高壓蒸氣滅菌鍋滅菌時(shí)，滅菌鍋內(nèi)冷空氣的排除是否完全極為重要，因?yàn)榭諝獾呐蛎泬捍笥谒?/p>

24、蒸氣的膨脹壓，所以，當(dāng)水蒸氣中含有空氣時(shí)，在同一壓力下，含空氣蒸氣的溫度低于飽和蒸氣的溫度。當(dāng)含鹽類(lèi)的液體和含鹽的瓊脂中大量的鹽類(lèi)潑灑在工作腔體，要立即換水，沖洗腔體，仔細(xì)擦干鍋蓋墊圈上的水滴。否則它們會(huì)帶來(lái)腐蝕和變質(zhì)。要檢查壓力表上的指數(shù)為“0 MPa”后才能打開(kāi)鍋蓋。外來(lái)物質(zhì)（金屬、液體）不能堵塞通風(fēng)孔，否則會(huì)引起裝置故障、起火、短路。,,過(guò)濾除菌,過(guò)濾除菌是通過(guò)機(jī)械作用濾去液體或氣體中細(xì)菌的方法。根據(jù)不同的需要選用不同的濾器

25、和濾板材料。此法除菌的最大優(yōu)點(diǎn)是可以不破壞溶液中各種物質(zhì)的化學(xué)成分，但由于濾量有限，所以一般只適用于實(shí)驗(yàn)室中小量溶液的過(guò)濾除菌。,,紫外線滅菌,紫外線滅菌是用紫外線燈進(jìn)行的。波長(zhǎng)為200~300 nm的紫外線都有殺菌能力，其中以260nm的殺菌力最強(qiáng)。在波長(zhǎng)一定的條件下，紫外線的殺菌效率與強(qiáng)度和時(shí)間的乘積成正比。紫外線殺菌機(jī)理主要是因?yàn)樗T導(dǎo)了胸腺嘧啶二聚體的形成和DNA鏈的交聯(lián)，從而抑制了DNA的復(fù)制。另一方面，由于輻射能使空

26、氣中的氧電離成[O]，再使O2氧化生成臭氧（O3）或使水（H2O）氧化生成過(guò)氧化氫（H2O2）。O3和H2O2均有殺菌作用。,紫外線穿透力不大，所以，只適用于無(wú)菌室，接種箱，手術(shù)室內(nèi)的空氣及物體表面的滅菌。紫外線燈距照射物以不超過(guò)1.2m為宜。為了加強(qiáng)紫外線滅菌效果，在打開(kāi)紫外燈前，可在無(wú)菌室內(nèi)(或接種箱內(nèi))噴灑3%～5%石炭酸溶液，一方面使空氣中附著有微生物的塵埃降落，另一方面也可以殺死一部分細(xì)菌。無(wú)菌室內(nèi)的桌面、凳子可用2%

27、～3%的來(lái)蘇爾擦洗，然后再開(kāi)紫外燈照射，即可增強(qiáng)殺菌效果，達(dá)到滅菌目的。,,滅菌的試管培養(yǎng)基冷至50 ℃ 左右再擱置，以防斜面上冷凝水太多。斜面長(zhǎng)度不超過(guò)試管總長(zhǎng)的一半。,,將滅菌的培養(yǎng)基放入37℃的溫室中培養(yǎng)24－48小時(shí)，以檢查滅菌是否徹底。,作業(yè),實(shí)驗(yàn)報(bào)告思考題1：培養(yǎng)基配置好后，為什么必須立即滅菌？如何檢查滅菌后的培養(yǎng)基是否為無(wú)菌的？思考題2：如果需要配制一種含有某抗生素的固體培養(yǎng)基，其中抗生素的終質(zhì)量濃度（或工作濃