獸用疫苗保護(hù)劑和佐劑

1、獸用疫苗凍干保護(hù)劑和佐劑,凍干保護(hù)劑（穩(wěn)定劑）保護(hù)劑：又稱穩(wěn)定劑（stabilizer） ，是指一類能防止生物活性物質(zhì)在冷凍真空干燥時受到破壞的物質(zhì)。（指對疫苗生產(chǎn)、血清制備等）保護(hù)劑用途（不同用途加不同保護(hù)劑, 主要針對活的微生物或細(xì)胞） ① 菌種或毒種保存：常用甘油作保護(hù)劑 ② 細(xì)胞株保存：常用二甲基亞砜(DMSO) DMSO:二甲基亞砜，一種細(xì)胞的保護(hù)劑 ③ 疫苗冷凍真

2、空干燥制備時：加脫脂乳（或二甲基亞 砜）和蔗糖等（不同國家有不同配方） ④ 干擾素類生物活性物質(zhì)的保存：加葡聚糖,保護(hù)劑（protector）的分類,分類：（根據(jù)其作用機(jī)理）——滲透劑：如二甲基亞砜（DMSO）、甘油和蔗糖等——非滲透劑：如聚乙烯吡咯啶酮(PVP)和蛋白質(zhì)等（根據(jù)其分子量大?。叻肿游镔|(zhì)、低分子物質(zhì)。（按其化學(xué)性質(zhì)）——復(fù)合物、糖類、鹽類、醇類、酸類和聚合物,復(fù)合物

3、 脫脂乳、明膠、蛋白質(zhì)、蛋白胨、糊精、血清、甲基纖維素等糖類 蔗糖、乳糖、麥芽糖、葡萄糖、果糖等鹽類 乳酸鈣、谷氨酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、醋酸銨、硫代硫酸鈉等醇類 山梨醇、甘油、甘露醇、肌醇、木糖醇等酸類 檸檬酸、酒石酸、氨基酸等聚合物 葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等,一些常用的冷凍干燥保護(hù)劑,分 類

4、 保 護(hù) 劑,,,,疫苗凍干保護(hù)劑組成1. 營養(yǎng)液： 可修復(fù)因凍干而受損的細(xì)胞，使凍干制品含有一定量水分； 可促進(jìn)高分子物質(zhì)形成骨架，使凍干制品呈多孔的海綿狀， 增加溶解度2. 賦形劑： 防止低分子物質(zhì)的碳化和氧化，保護(hù)活性物質(zhì)不受加熱影響 使凍干制品形成多孔性、疏松的海綿狀物，增加溶解度3. 抗氧化劑： 抑制凍干制品中的酶作用，增加生

5、物活性物質(zhì)在凍干后貯存期間的穩(wěn)定性，如維生素C、維生素E和硫代硫酸鈉等。,① 防止活性物質(zhì)失去結(jié)構(gòu)水及阻止結(jié)構(gòu)水形成結(jié)晶而導(dǎo)致生 物活性物質(zhì)的損傷；② 降低細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓差、防止細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)水結(jié)晶，以保 持細(xì)胞的活力；③ 保護(hù)或提供細(xì)胞復(fù)蘇所需的營養(yǎng)物質(zhì)，有利于生活力的復(fù) 蘇和迅速修復(fù)自身。,凍干保護(hù)劑作用機(jī)制,二、影響保護(hù)劑效能的因素 1、保護(hù)劑種類: 根據(jù)微生物種類或者用途來添加不同種 類保護(hù)劑。２

6、、保護(hù)劑濃度：嚴(yán)格按照配方執(zhí)行。３、保護(hù)劑配制方法：糖類不能用121℃高壓滅菌處理。４、保護(hù)劑酸堿度（PH值）：主要對M的影響。,三、常用的凍干保護(hù)劑（穩(wěn)定劑） 明確不同種類微生物需要添加不同保護(hù)劑（一）細(xì)菌的保護(hù)劑 ① 需氧或兼氧厭氧菌：５％蔗糖脫脂乳或５％蔗糖、 1.5％明膠；　　　　　　　　　　　　　 ② 厭氧性細(xì)菌：含1.5％

7、谷氨酸鈉的１％乳糖或10％脫 脂乳或7.5％葡糖血清。 注：脫脂乳：20％脫脂奶粉溶于水配制而成。（二）病毒的保護(hù)劑 ① 5%蔗糖 脫脂乳； ② 馬立克814活細(xì)胞疫苗:保存液氮.穩(wěn)定劑為10%二 甲基亞砜和50%犢牛血清的199液。 注意: 微生物保護(hù)劑緩沖液的組成比例，不同廠家有

8、 不同的配方。,1．5%蔗糖（乳糖）脫脂乳保護(hù)劑 蔗糖（或乳糖）5g，加脫脂乳至100ml，充分溶解后，110~116℃高壓滅菌30~40 min。 2．明膠蔗糖保護(hù)劑明膠2%~3%（g/m1）、蔗糖5%（g/m1）、硫脲 1%~2%（g/m1）。先將12%~18%明膠液、30%蔗糖液和6%~12%硫脲液加熱溶解，116℃高壓滅菌30~40min； 3．SPGA保護(hù)劑,獸醫(yī)生

9、物制品常用的保護(hù)劑,蔗糖 76.62g、磷酸二氫鉀0.52g、磷酸氫二鉀1.64g、谷氨酸鈉0.83g、牛血清白蛋白10g、加去離子水至1000ml，混合溶解，過濾除菌。,免疫佐劑,一、佐劑概念與作用機(jī)理1. 佐劑（新概念）：凡是可以增強(qiáng)抗原特異性免疫應(yīng)答的物質(zhì)稱為佐劑。 佐劑（舊概念）：當(dāng)一種物質(zhì)先于抗原或與抗原混合或同時注射于動物體內(nèi)，能非特異性地改變或增強(qiáng)機(jī)體對該抗原的特異性免疫應(yīng)答,發(fā)揮其輔佐作用的物質(zhì). 以前

10、作為佐劑使用時沒有免疫原性，但現(xiàn)在有所改變，如IL-2是佐劑和IL-8一類細(xì)胞因子佐劑卻不一樣, 具有免疫調(diào)節(jié)和免疫增強(qiáng)作用,單獨(dú)使用時卻具有免疫原性。注意:佐劑和免疫增強(qiáng)劑的關(guān)系? 有時佐劑也是免疫增強(qiáng)劑.,作用特點(diǎn)：① 明顯增強(qiáng)抗原性微弱的物質(zhì)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生 特異性免疫應(yīng)答。② 用最少的抗原和最少的接種次數(shù)，產(chǎn)生足 夠的免疫應(yīng)答。,免疫佐劑作用機(jī)理,① 改變正常免疫機(jī)能，吸引大量巨噬細(xì)胞以吞噬抗原；

11、② 改變抗原的構(gòu)型，使抗原物質(zhì)降解，并加強(qiáng)其免疫原性；③ 延長抗原在組織內(nèi)的貯存時間，使抗原緩慢降解和緩釋， 并發(fā)揮免疫系統(tǒng)的細(xì)胞間協(xié)同作用（巨噬細(xì)胞與T細(xì)胞， T細(xì)胞與B細(xì)胞）。,作用方式,① 抗原遞呈（antigen presentation） ② 抗原尋的（antigen targeting）③ 免疫調(diào)節(jié)（immune modulation）,作用機(jī)理,①抗原遞呈： 指抗原分子遞呈給T細(xì)胞的方法。佐劑與疫苗

12、聯(lián)合使用，有助于抗原性物質(zhì)在胞內(nèi)被加工，被MHC分子特異性的結(jié)合、保護(hù)、運(yùn)輸并遞呈給效應(yīng)細(xì)胞。,②抗原尋的（antigen targeting） 指抗原傳遞給免疫系統(tǒng)中適當(dāng)效應(yīng)細(xì)胞的效率。包括吸引巨噬細(xì)胞到達(dá)組織部位、活化吞噬細(xì)胞、促進(jìn)抗原與細(xì)胞受體的結(jié)合等有重要作用。,③免疫調(diào)節(jié)（immune modulation） 是指任何可以修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞對抗原或表位進(jìn)行加工的機(jī)制。通過這種機(jī)制，可以改變特異性免疫應(yīng)答的本質(zhì)或強(qiáng)度。T細(xì)

13、胞有Th1和Th2兩個亞類。同一抗原和不同佐劑一起使用能夠引起不同的免疫反應(yīng)。因此，通過篩選特定的佐劑，可以達(dá)到誘導(dǎo)正確的免疫應(yīng)答的目的。,1. 按佐劑物理性質(zhì) 顆粒型佐劑 非顆粒型佐劑2. 按佐劑的生物學(xué)性質(zhì)（即Ballanti分類法） 微生物及其組分 非微生物物質(zhì)3. 按佐劑在體內(nèi)存留的時間 貯存型佐劑（depot type adjuvant） 非貯存型（non-depot type adjuvant）,

14、佐劑的分類,（一）顆粒性佐劑1．鹽類佐劑 氫氧化鋁膠、明礬、磷酸鋁等。2．油水乳劑佐劑 弗氏完全佐劑（Freund’s complete adjuvant, FCA）、弗 氏不完全佐劑（ FIA）和礦物油白油佐劑。3．免疫刺激復(fù)合物佐劑（ISCOM）4．蜂膠佐劑（propolis）5．脂質(zhì)體佐劑（liposomes）。6．其他：MF59佐劑、微囊化佐劑（micro-encapsulation)

15、、 硬脂酰酪氨酸佐劑和γ－菊粉等。,（二）非顆粒性佐劑1．肽類佐劑（peptides）：胞壁酰二肽（MDP）及其衍生物、 去胞壁酰多肽、脂肽和免疫調(diào)節(jié)多肽。2．表面活性分子類佐劑：海藻糖合成衍生物（TDM）3．核酸及其衍生物類佐劑：合成核苷酸聚合體、CpG 4．含硫復(fù)合物類佐劑：左旋咪唑5．碳水化合物高分子類佐劑：香菇多糖、DEAE-葡聚糖6．細(xì)胞因子類佐劑（cytokine）：IL-2、IL-4和γ-

16、IFN等。7．脂質(zhì)分子類佐劑：脂多糖、Vit A和Vit E等脂溶性維生素8．其他：霍亂毒素（CT）、百日咳毒素（PT）和破傷風(fēng)類 毒素（TT）等；脂磷壁酸（LTA）；維生素B12等。,合成方法: （1）用鋁粉加燒堿合成法 2Al(OH)3+12H2O+3H2SO4→Al2(SO4)3·18H2O   

17、 A12(SO4)3·18H2O+6NaOH→2Al(OH)3+2Na2SO4+18H2O（2）用明礬加碳酸鈉合成法 2 KAl(SO4)2+3 Na2CO3+3H2O→2Al(OH)3+3Na2SO4+3CO2↑ （3）用三氯化鋁與氫氧化鈉合成 A1C13+3NaOH→Al(OH)3↓+3NaCl,氫氧化鋁膠 (鋁膠）,用鋁粉加燒堿合成

18、法： 2Al(OH)3+12H2O+3H2SO4→Al2(SO4)3·18H2O    A12(SO4)3·18H2O+6NaOH→2Al(OH)3+2Na2SO4+18H2O,用銅紗篩濾過，用布袋脫水過夜，收存于容器內(nèi)，可約得600kg鋁膠。,取氫氧化鋁干粉50～55kg，加入6萬毫升沸水中，攪拌均勻;倒入硫酸100kg，爆沸至棕褐色，經(jīng)30～60min后，加溫水，邊加邊攪拌

19、約至總量為35萬毫升；用前加水稀釋至100萬毫升，溫度約為80℃，盛裝在一個缸內(nèi),另一缸盛80kg燒堿，加水至100萬毫升，加溫至75℃,兩液等量逐漸流入另一耐酸搪瓷缸內(nèi)，蒸汽吹沸熟化10min，調(diào)節(jié)pH 6.9土0.1，繼續(xù)熟化3min，穩(wěn)定pH 6.9土0.1,靜置沉淀，棄上清后加入約5倍量軟化水，攪拌洗滌、棄上清，如此3～5次，檢查至硫酸鹽合格為止。,,,,,① 氫氧化鋁吸附力較強(qiáng)，所以要用軟化水或去離子水洗滌。② 氫氧化鋁膠為

20、兩性化合物，過酸或過堿都會失去膠態(tài)。故要 掌握好化合時的pH值。③ 貯存鋁膠應(yīng)放在耐酸搪瓷缸或耐酸池中，嚴(yán)密封蓋，貯放期 不超過3個月。④ 鋁膠室溫保存，以免破壞膠態(tài)。,注意事項(xiàng),是指一類由油類物質(zhì)和乳化劑按一定比例混合形成的佐劑。 該類佐劑主要在抗原尋的過程中起作用，使抗原在注射部位保持穩(wěn)定，為抗原在淋巴系統(tǒng)中轉(zhuǎn)運(yùn)提供載體，增加單核細(xì)胞的形成和積聚。油乳劑疫苗的免疫效力高低，直接與乳化作用的好壞和乳劑成分的質(zhì)量等

21、有關(guān)。一種好的乳劑疫苗應(yīng)是油包水（W/O）或水包油（O/W）型，粘度低，顆粒均勻，穩(wěn)定性良好，呈乳白色?！叭閯笔菍⒁环N溶液或干粉分散成細(xì)小的微粒，混懸于另一不相溶的液體中所成的分散體系。被分散的物質(zhì)稱為分散相（內(nèi)相），承受分散相的液體稱連續(xù)相（外相），兩相間的界面活性物質(zhì)稱為乳化劑。,油乳佐劑,乳化劑 天然乳化劑：阿拉伯膠、海藻酸鈉、蛋黃以及煉乳 人工合成乳化劑離子型 陰離子類乳化劑：十二烷基磺酸鈉和硬脂酸鋁 陽

22、離子類乳化劑：氯化苯甲烴銨、溴化十六烷三甲基非離子型：月桂酸聚甘油脂、山梨醇脂和單油酸脂、 司本-80、吐溫-80,白油佐劑國內(nèi)外常用白油：Drakocel-6VR、Marcol-52和Lipolul-4 7號或10號白油質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn): 無色無味 50℃運(yùn)動粘度7m2／s左右 紫外吸收A250-350＜0.1％，紫外消光系

23、數(shù)＜12×108； 單環(huán)芳烴與雙環(huán)芳烴含量低于0.5％，無多環(huán)芳烴； 小鼠腹腔注射0.5ml或家免皮下注射2.0ml白油，觀察60d，表現(xiàn)正常。,乳劑配方與乳化方法（1）劑在水中法： 將乳化劑直接溶于水中，在激烈攪拌下將油加入，可直接生成O/W乳劑。若欲得W/O型，可繼續(xù)加入油，直到發(fā)生變型。該法通常用勻漿器或膠體磨，高速攪拌而得到較好的乳劑。（2）劑在油中法： 將乳化劑溶于油相，將油相直接加入水相中

24、得O/W，如水相直接加入油相，得到W/O型，如欲得O/W，繼續(xù)加入至變型。該法制成的乳劑，一般均勻顆粒直徑在0.5µm左右，比較穩(wěn)定。,免疫實(shí)驗(yàn)動物用的佐劑配制: (1)弗氏佐劑：礦物油75%~85％，乳化劑15％~25%，混合后經(jīng)除菌過濾而成為FIA；如向其中加入0.5mg／m1死結(jié)核桿菌即為FCA。使用時，將含抗原的水相，與上述任一佐劑等量混合，用力振搖即可成為均勻的乳劑。(2) 白油佐劑：9份油和1份司本-80混合后

25、加2％吐溫-80和1％~2%硬脂酸鋁，經(jīng)高壓滅菌后備用，注射前將配好的油佐劑與抗原水相1：1混合，強(qiáng)力振搖，可配制成性狀良好的乳劑疫苗。,大量生產(chǎn)乳劑疫苗: 油相: 94％白油、6％司本-80、1%~2％硬脂酸鋁，滅菌即可； 水相：抗原液加2％~4%吐溫-80 乳化：將油相與水相按3：1~2：1比例配制，先緩速混合，再 通過膠體磨充分乳化，可獲得穩(wěn)定的油包水乳劑苗。 或者將粘稠的W/O乳劑疫苗，再加

26、2％吐溫-80生理鹽 水，通過攪拌或膠體磨乳化，可制成雙相乳劑疫苗。,油乳劑檢驗(yàn)（1）粘度測定：流出法、Saybolt粘度計(jì)法。吸管內(nèi)口直徑為1.2mm，室溫下吸滿lml乳劑，垂直放出0.4ml所需時間作為粘度單位。以 2-6 S為合格，不得多于10-15 S。（2）乳劑穩(wěn)定性測定：① 加速老化法：疫苗于37℃貯存10-30d不破乳。② 離心加速分層法：3000rpm離心15min不分層，相當(dāng)于保存1年以上

27、不破乳。,蜂膠佐劑（ Propolis）,是一種優(yōu)良的天然藥物 供免疫佐劑用的蜂膠外觀應(yīng)具備其固有的特征 具有廣泛的生物活性和藥理作用（抗菌、抗病毒、抗腫瘤、消炎） 具有免疫增強(qiáng)作用： 能保持抗原特性，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力，促進(jìn)抗體的 產(chǎn)生，提高機(jī)體的特異性和非特異性免疫力。,（1）蜂膠的處理： 蜂膠（4℃以下貯存） 粉碎過篩 按1：4（W/V）加95％乙醇 室溫浸泡24～48h

28、 冷卻 過濾或離心取上清 透明栗色純凈蜂膠浸液 4℃以下保存?zhèn)溆?除去干渣計(jì)算出浸液中含蜂膠量。（2）蜂膠佐劑疫苗的制備： 滅活菌液或病毒液，加入蜂膠乙醇浸液，使每毫升菌液中含蜂膠10mg，邊加邊搖蕩，成為乳濁狀，即可。,,蜂膠佐劑疫苗制備方法：,,,,,,,,細(xì)胞因子類免疫佐劑 （cytokine）,細(xì)胞因子的概念 是機(jī)體的各種細(xì)胞在其生命周期中所釋

29、放的具有不同生物學(xué)效應(yīng)的物質(zhì)，是免疫細(xì)胞間相互作用的調(diào)節(jié)信號。該類物質(zhì)相互誘生，相互影響，構(gòu)成一個巨大的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)（cytokine network）系統(tǒng)，各種細(xì)胞借助自己所釋放的細(xì)胞因子完成各自的功能，在免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用。,細(xì)胞因子類免疫佐劑 （cytokine）,細(xì)胞因子的分類（根據(jù)生物活性）1. 經(jīng)典的細(xì)胞因子：淋巴毒素（LT）、腫瘤壞死因子（TNF）

30、干擾素（INF）2. 對體液免疫和細(xì)胞免疫具有調(diào)節(jié)作用的因子： 白細(xì)胞介素（IL）和集落刺激因子（CSF）,1．多效性： ①免疫調(diào)節(jié)作用的多樣性 ②作用方式的非特異性：不表現(xiàn)抗原特異性2．靶細(xì)胞的多樣性：構(gòu)成機(jī)體細(xì)胞—細(xì)胞調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)3．多源性：4．高效性：有免疫激素（immune hormone）之稱5．快速反應(yīng)性：即對激發(fā)因素的迅速反應(yīng),

31、細(xì)胞因子的作用特點(diǎn),多樣性Pleiotropism 交叉性Redundancy 協(xié)同性Synergy 對抗性Antagonism,1．作為免疫佐劑，提高疫苗的免疫效果2．作為免疫治療劑，預(yù)防和治療某些病原感染3．通過基因重組，構(gòu)建新型基因工程疫苗 IL-2-AIV-HA重組痘病毒,細(xì)胞因子的應(yīng)用,幾種重要的細(xì)胞因子,白細(xì)胞介素-2（IL-2） 白細(xì)胞介素-4（IL-4） 白細(xì)胞介素-12（IL-

32、12） γ -干擾素（IFN-γ）,刺激物為抗原或促有絲分裂原（ConA）； T細(xì)胞分泌； 無抗原特異性 糖蛋白，含133aa ，分子量15-35kDa； 70℃30min及pH值2-9范圍內(nèi)穩(wěn)定,IL-2,刺激物：抗原或絲裂原；由Th細(xì)胞產(chǎn)生分子量15～20kDa，有2～3個糖基化部位，140個氨基酸一種強(qiáng)有力的佐劑候選因子,IL-4,是目前發(fā)現(xiàn)的唯一主要由B細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，與IL-2有協(xié)同作用，所以曾被稱為細(xì)胞毒淋

33、巴細(xì)胞成熟因子（CLMF）和天然殺傷細(xì)胞刺激因子（NKSF）。 糖蛋白，分子量75kDa，由40kDa（P40）和35kDa（P35）兩個亞單位構(gòu)成，兩個亞單位完全由不同的基因所編碼，只有結(jié)合為一個完整的分子時才能發(fā)揮生物學(xué)活性。 IL-12活性高于IL-2和IFN，在極低濃度時就有顯著活性，對滅活疫苗、腫瘤和寄生蟲抗原具有有效的佐劑活性。 IL-12誘導(dǎo)產(chǎn)生的Th1應(yīng)答反應(yīng)尤為引人注目，可望用于主要誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答的疫苗佐

34、劑。,IL-12,由致敏T細(xì)胞在活的或滅活的病毒等干擾素誘生劑和某些細(xì)胞因子作用下所產(chǎn)生； 糖蛋白，分子量20～25kDa，由144個氨基酸組成。 有抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和免疫佐劑等免疫生物學(xué)活性。 目前IFN-γ與抗原雜合的融合分子的研究是個熱點(diǎn)，期待其成為一個有效的佐劑。,IFN-γ,目前，我國已開發(fā)研制成功豬白細(xì)胞干擾素（swine interferon）。該制品系用雞新城疫病毒誘導(dǎo)健康豬白細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)、滅活病毒、除菌、

35、分裝等工藝制成。用于防治豬流行性腹瀉。,CpG DNA，CpG OND,CpG DNA：指含有非甲基化CpG（胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸）基序的脫氧核糖核酸DNA。 CpG基序（ motif）：指以非甲基化的CpG為基元構(gòu)成的回文序列，其堿基排列大多為5′--Pur Pur- CG- Pyr Pyr--3′，具有較強(qiáng)免疫活性，稱為免疫刺激序列（ISS，immunostimulatory DNA sequences）。 CpG ON

36、D：含有非甲基化CpG基序的寡聚脫氧核苷酸 。,細(xì)胞因子的分泌和細(xì)胞的分化,CpGDNA的免疫刺激效應(yīng)（作用機(jī)制）,,,,溫度\能量,,,酸化內(nèi)體小泡,,,,,,,,,,,,,,,,,,DNA-PK,TLR-9,胞質(zhì)內(nèi)受體蛋白,有絲分裂原蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子等信號通路,,,,,引起B(yǎng)細(xì)胞分化，分泌IL-6、IL-10等細(xì)胞因子和表達(dá)MHCII、B7-1、B7-2等表面分子，并阻止B細(xì)胞的凋亡。 直接激活單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞，分

37、泌IL-12、INF-r等Thl樣為主的細(xì)胞因子，并刺激MHCII、B7-1、B7-2的表達(dá)。 在IL-12協(xié)同下激活NK細(xì)胞，殺傷活性增強(qiáng)，并分泌IFN-r，IFN-r反過來進(jìn)一步促進(jìn)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞的激活。 協(xié)同刺激抗原特異性B細(xì)胞和T細(xì)胞分化，在Thl細(xì)胞因子的作用下，顯著增強(qiáng)獲得性細(xì)胞免疫----優(yōu)良的T細(xì)胞免疫佐劑。,1． CpGDNA對多種免疫細(xì)胞有激活作用,含有GACGTT-基序的CpG OND——小鼠淋巴

38、細(xì)胞含有AGCGTG基序的CpG OND——小鼠的NK細(xì)胞含有GTCGTT基序的CpG OND——人淋巴細(xì)胞含有ATCGAT基序的CpG OND——雞外周血單核細(xì)胞含有GTCGTT基序的CpG OND—牛B細(xì)胞的增殖和分泌IL-6 —PBMC分泌IL-

39、6、IL-l2和IFN-r；含有ATCGAT基序的CpG OND——豬 (Kamstrup，2001),2．CpG OND免疫刺激作用具有物種和細(xì)胞特異性,CpGODN的體內(nèi)效應(yīng)與應(yīng)用1．對天然免疫系統(tǒng)的刺激活性 （1）抗感染 ：單核李斯特桿菌、利什曼原蟲、

40、 瘧原蟲、單純皰疹病毒 （2）抗腫瘤活性 ：黑色素瘤 2. 對特異性免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用—疫苗佐劑 （1）CpG ODN對蛋白質(zhì)抗原的作用 能夠增強(qiáng)許多抗原誘導(dǎo)的Thl型反應(yīng)—HbsAg、牛皰疹病毒I型糖蛋白 D、淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒、瘧疾的多肽、麻疹病毒、放線桿菌 胸膜肺炎、流感病毒疫苗、貓皰疹病毒、貓細(xì)小病毒和貓白血病病毒 （2）CpG ONG對DNA疫苗的作用3

41、．過敏性疾病治療,霍亂毒素（CT） 大腸桿菌不耐熱毒素（LT） 破傷風(fēng)類毒素（TT）,基因工程減毒素,（一）霍亂毒素（CT） 良好的粘膜免疫佐劑 由A和B兩個區(qū)構(gòu)成的蛋白 B區(qū)具有主要免疫學(xué)作用，內(nèi)含5種獨(dú)立的非共價連接的B亞單 位（CTB），無毒性，可與細(xì)胞結(jié)合。 A區(qū)是CT的生物學(xué)活性部分，具有酶活性。 仙臺病毒—CT；CTB—流感病毒HA；鏈球菌表面蛋白—CTB； CT毒素A和B兩個亞單位的表達(dá)質(zhì)粒

42、DNA作為佐劑與DNA疫苗聯(lián)和應(yīng)用，還可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生很強(qiáng)的Th1細(xì)胞因子反應(yīng)（如IFN-γ）和Th2細(xì)胞因子反應(yīng)（如IL-4），具有很強(qiáng)的佐劑作用。,（二）大腸桿菌不耐熱毒素（LT） 大腸桿菌LT毒素有A和B兩個亞單位，有一定抗原性 A亞單位基因工程點(diǎn)突變體LT(R192G) ——無毒性作用，但仍保留了其佐劑效應(yīng) ——可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生局部粘膜免疫反應(yīng)。利用基因突變技術(shù)，構(gòu)建的A和B兩個亞單位的表達(dá)質(zhì)粒DNA聯(lián)

43、合應(yīng)用，也可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生很強(qiáng)的Th1細(xì)胞因子反應(yīng)（IFN-γ）和Th2細(xì)胞因子反應(yīng)（IL-4）。而且，LT毒素表達(dá)質(zhì)粒作為佐劑，可協(xié)助DNA疫苗誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更強(qiáng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)，有望成為一種新型免疫增強(qiáng)劑。,免疫刺激復(fù)合物（ immunostimulating complex， ISCOM） ISCOM由抗原物質(zhì)與由皂樹皮提取的一種糖苷Quil A和膽固醇按1:1:1混合后自發(fā)形成的一種具有較高免疫活性的脂質(zhì)小泡。 ISCOM直徑

44、40nm，每個ISCOM約含10～12分子的蛋白質(zhì)。 ISCOM應(yīng)用于多種細(xì)菌、病毒和寄生蟲病的疫苗，具有產(chǎn)生“全面”免疫應(yīng)答的效力，可長期增強(qiáng)特異性抗體應(yīng)答。 ISCOM能有效地通過粘膜給藥，從而可以用于抗呼吸道感染。 目前，獸用ISCOM疫苗已在國外投放市場。,2、佐劑作用機(jī)理： 機(jī)理非常復(fù)雜，但可概括三個方面。（不同書有不同寫法） ①抗原儲存庫延長抗原儲存時間，延長抗原釋放，加強(qiáng)抗原降解等； ②形

45、成肉芽腫，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)吞噬細(xì)胞吞噬作用； ③刺激淋巴細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化。二、佐劑分類 不溶性鋁鹽類佐劑 油水乳劑佐劑 常用佐劑免疫 蜂膠佐劑

46、 細(xì)胞因子佐劑 佐劑 微生物及代謝產(chǎn)物佐劑 免疫刺激復(fù)合物（Iscom） 新型免疫佐劑 脂質(zhì)體佐劑（Liposomes） MF59佐劑,,,

47、,一）常用免疫佐劑1、鋁鹽類佐劑 氫氧化鋁膠：主要用于獸用細(xì)菌滅活苗（20%乳膠液）2、油水乳劑佐劑油乳佐劑是指一類由油類物質(zhì)和乳化劑按一定比例混合形成的佐劑。弗氏佐劑：礦物質(zhì)（液體石蠟）、乳化劑（羊毛脂）、卡介 苗組成 的油包水乳化佐劑（三種成分俱全成為弗 氏完全佐劑，不含卡介苗或死結(jié)核桿菌的為弗氏 不完全佐劑）很少用于疫苗，

48、因?yàn)樘恚⑸淅?難，但在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用廣。 礦物油：白油白油佐劑 乳化劑：司苯-80、硬脂酸鋁、吐溫-80 。,,,油乳劑疫苗生產(chǎn)方法見書上55頁。即油乳佐劑和病毒液或菌液按一定比例混合，經(jīng)攪拌（高油）或膠體磨乳化而成油乳劑疫苗：4℃以上保存，不能凍結(jié)，否則易分層即破乳（常溫下保存1年以上，都不分層）。3、蜂膠佐劑（見書）二) 新型免

49、疫佐劑 1、細(xì)胞因子類佐劑（相當(dāng)于胸腺肽、干擾素等因子作用） 干擾素（α、β（抗病毒）γ（免疫調(diào)節(jié)，抗腫瘤）細(xì)胞因子 白細(xì)胞介素（IL-1、 IL-2、IL-6、IL-12、 IL- 18…IL-21） 腫瘤壞死因子（TFN-α, T

50、FN-β 集落刺激因子,,2、CpG DNA:是含有非甲基化CpG基序的脫氧核糖核酸DNA，能誘生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答反應(yīng)。3、基因工程減毒素：蛋白質(zhì)毒素具有良好的抗原性，所以具有免疫佐劑作用，但不能直接作佐劑需要減毒。4、免疫刺激復(fù)合物（immunostimulating complexes, Iscom）：是由抗原物質(zhì)（20多種病毒的親水蛋白或細(xì)菌膜蛋白等）和Quil A（皂樹皮提取的一種糖苷)與膽固醇按