鉛離子與牛血清蛋白相互作用的光譜分析—畢業(yè)答辯

1、鉛離子與牛血清蛋白相互作用的光譜分析,2,目錄（Contents）,3,1.引言1）實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?分析鉛離子和牛血清蛋白相互作用的光譜特征。探究不同的實(shí)驗(yàn)條件：pH、牛血清蛋白濃度、鉛離子濃度、離子強(qiáng)度對(duì)鉛離子-牛血清蛋白體系光譜的影響。探索最佳試驗(yàn)條件。,2）研究背景： 牛血清蛋白,在生物體中，蛋白質(zhì)是極為重要的生命物質(zhì)，在生命的運(yùn)動(dòng)和發(fā)展中起著關(guān)鍵的作用。有關(guān)蛋白質(zhì)的組成、構(gòu)象及與小

2、分子相互作用機(jī)理的研究是目前從事化學(xué)、化學(xué)生物學(xué)、生命科學(xué)、藥學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)科技工作者共同關(guān)注和感興趣的課題。,4,5,鉛離子,鉛是進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)、科學(xué)研究不可缺少的物質(zhì)之一，在人類的生產(chǎn)生活中起著重要的作用。鉛又是對(duì)人類和高等生物中最具危害的有毒元素之一，鉛污染問題己給人類造成了多種災(zāi)害。鉛即可造福人類，又會(huì)造成環(huán)境的污染。因此，尋求高靈敏度和高選擇性的檢測(cè)方法對(duì)其進(jìn)行檢驗(yàn)，具有理論和實(shí)際的意義。,6,常用檢測(cè)方法及其特點(diǎn)1）紫外

3、吸收光譜分析,這是了解溶液中蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的一種常規(guī)方法。具有靈敏度高、用量少的特點(diǎn)。觀察牛血清蛋白的特征吸收峰是否發(fā)生位移或者峰值變化可粗略知道物質(zhì)是否與BSA發(fā)生了作用。物質(zhì)的紫外及可見光譜不能完全決定物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)，還必須與紅外光譜或者質(zhì)譜等分析方法綜合運(yùn)用，才可以得出可靠的結(jié)論。,Use this box to highlight,7,紅外光譜法,紅外光譜法是研究蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)特性的有效工具。具有特征性強(qiáng)，專一性高

4、，定量范圍廣等特點(diǎn)。熒光光譜法靈敏度高選擇性好，用量少，能提供較多的物理參數(shù)。但是適應(yīng)性差，應(yīng)用范圍不夠廣泛，熒光對(duì)環(huán)境因素敏感。,8,2.實(shí)驗(yàn)部分,2.1 試劑2.2 實(shí)驗(yàn)器材2.3 實(shí)驗(yàn)試劑的配制2.4 Pb-BSA體系光譜分析,2.1實(shí)驗(yàn)試劑,BEA Confidential. | 9,10,2.2實(shí)驗(yàn)儀器,970CRT型熒光分光光度計(jì),上海分析儀器總廠UV-7502PC型紫外-可見分光光度計(jì)，日本島津電子天平

5、, 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司10-1000μL移液槍Nicolet6700紅外光譜儀，美國熱電公司,2.3溶液的配制,緩沖液的配制BSA溶液的配制硝酸鉛溶液的配制配制含不同濃度的鉛離子的Pb-BSA體系配制含不同pH的Pb-BSA體系配制含不同濃度BSA的Pb-BSA體系,11,2.4光譜測(cè)定步驟：,熒光：激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)定為240nm，測(cè)量200-600nm處的熒光光譜。所有測(cè)量均在室溫(15±2℃)下進(jìn)行。激發(fā)

6、和發(fā)射單色器狹縫均為5nm。紫外：均用二次蒸餾水建立基線。掃描范圍200-600nm。紅外：測(cè)定不同濃度鉛離子下Pb-BSA體系的紅外光譜圖。,12,牛血清蛋白的紅外光譜圖,BEA Confidential. | 13,BSA酰胺I帶紅外吸收峰的歸屬,蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)是指蛋白質(zhì)分子中多肽鏈本身的折疊方式比如 α-螺旋、β-折疊 、β-轉(zhuǎn)角等。,BEA Confidential. | 14,牛血清蛋白的酰胺I帶紅外光譜圖,可以

7、看到，酰胺I帶的紅外最大吸收位于1650cm-1附近，表明牛血清蛋白以α-螺旋螺旋結(jié)構(gòu)為主。,BEA Confidential. | 15,不同濃度鉛離子下體系的紅外二階導(dǎo)數(shù)圖,BEA Confidential. | 16,B-N鉛離子濃度依次為1×10-6 mol/L，2×10-6 mol/L 3×10-5mol/L,2×10-4 2×10-3mol/L,從圖中可以觀察，β-轉(zhuǎn)

8、角增加， α-螺旋減小，β-片層增加,17,2）不同pH下體系的紫外光譜圖,,1-6 pH:6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,8.5,18,,從圖中可以看出在pH=7.5時(shí)峰強(qiáng)度最弱。血清白蛋白在280nm附近的吸收峰是其肽鏈上2個(gè)色氨酸和19個(gè)酪氨酸殘基的芳雜環(huán)的π-π*躍遷引起的，而240nm附近的吸收則主要是肽鍵 C=O基的 n-π*躍遷引起，在 BSA等電點(diǎn)之后，隨著體系中pH的降低，使得 BSA分子間作用增強(qiáng)，有利于分

9、子間和分子內(nèi)的團(tuán)聚作用，使蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象改變，α-螺旋含量減少。同時(shí)由于體系pH值的降低，出現(xiàn)蛋白質(zhì)肽鏈的伸展現(xiàn)象，血清白蛋白的結(jié)構(gòu)改變，使得包圍在白蛋白分子內(nèi)部的色氨酸，酪氨酸殘基的芳雜環(huán)疏水基團(tuán)裸露出來，疏水基之間作用增強(qiáng)，躍遷能量增大。,不同濃度鉛離子下體系的熒光譜圖,19,1-7鉛離子濃度分別為0，1×10-6mol/L，2 ×10-6mol/L，1 ×10-5mol/L，2 ×10-5

10、mol/L，2 ×10-4mol/L，4 ×10-4mol/L,熒光：激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)定為240nm，測(cè)量200-600nm處的熒光光譜。所有測(cè)量均在室溫(15±2℃)下進(jìn)行。激發(fā)和發(fā)射單色器狹縫均為5nm。血清蛋白能夠發(fā)出熒光是因?yàn)榇嬖谌N芳香族，氨基酸：色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸．這些氨基酸的結(jié)構(gòu)不同，造成熒光強(qiáng)度之比為100：9：0.5。從圖中可知牛血清蛋白的發(fā)射波長(zhǎng)在270nm鉛離子濃度逐漸增加，發(fā)射峰

11、發(fā)生藍(lán)移，BSA的內(nèi)源熒光強(qiáng)度有規(guī)律地降低，且發(fā)射峰的峰形均基本不變，說明鉛離子對(duì)BSA有熒光猝滅作用。,4.結(jié)論,通過光譜分析可知，最佳的實(shí)驗(yàn)條件：pH=7.5,NaCl（離子強(qiáng)度）濃度為0.0045mol/L，BSA濃度為3×10-5mol/L，鉛離子濃度為3×10-6mol/L，選擇磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀緩沖液。鉛離子會(huì)引起牛血清蛋白的熒光猝滅。鉛離子存在時(shí)造成BSA的β-轉(zhuǎn)角增加，α-螺旋減小，β-片層增