課程章節(jié)-新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院歡迎您！

1、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn),徐志浩 15294858210遺傳與基因工程教研室院系樓西側(cè)一樓2016年,光學(xué)顯微鏡技術(shù)、細(xì)胞的形態(tài)觀察(1-26)培養(yǎng)細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇 (P80)動(dòng)物細(xì)胞的原代培養(yǎng)(P82)小鼠骨髓染色體標(biāo)本的制備及觀察(P53)細(xì)胞分裂標(biāo)本的制備及觀察(P65),醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn),一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解細(xì)胞培養(yǎng)的基本原理。初步掌握細(xì)胞原代培養(yǎng)的基本方法。掌握細(xì)胞培養(yǎng)過程中無菌操作的方法和注意事項(xiàng)

2、。了解培養(yǎng)中的動(dòng)物細(xì)胞的一般形態(tài)。,醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn),相關(guān)概念體外培養(yǎng)：是指在體外模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，培養(yǎng)從機(jī)體中取出的細(xì)胞、組織或器官，并使之生存和生長的一系列操作。,二、實(shí)驗(yàn)原理,醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn),原代培養(yǎng)：取自體內(nèi)新鮮組織置于體外進(jìn)行的首次原代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)：細(xì)胞在培養(yǎng)器皿中生長一定時(shí)間后，被接種到新的培養(yǎng)器皿中繼續(xù)培養(yǎng)的過程。,,,細(xì)胞培養(yǎng)(cell culture) 組織培養(yǎng)器官培養(yǎng)。,無機(jī)鹽、氨基酸、維生素、糖

3、類等基本物質(zhì),醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn),細(xì)胞培養(yǎng)的條件,,營養(yǎng)物質(zhì),無菌無毒環(huán)境：體外培養(yǎng)首要條件，無菌并及時(shí)清除代謝產(chǎn)物。溫度：人和哺乳動(dòng)物的適宜溫度35-37℃氣體環(huán)境：O2(三羧酸循環(huán))和CO2(5％, 調(diào)節(jié)pH)pH：7.2-7.4弱堿環(huán)境滲透壓：適當(dāng)?shù)碾x子濃度,環(huán)境,尤其針對附著生長的細(xì)胞,,介質(zhì),細(xì)胞培養(yǎng)的條件,,無菌環(huán)境溫度氣體環(huán)境營養(yǎng)物質(zhì)pH滲透壓介質(zhì),培養(yǎng)箱,培養(yǎng)基和培養(yǎng)用液,培養(yǎng)容器,,,醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)

4、實(shí)驗(yàn),細(xì)胞培養(yǎng)的主要試劑,基礎(chǔ)培養(yǎng)基：RPMI 1640、DMEM 、 MEM等。血清（天然成分）：牛血清最常用、偶有用馬血清?？股兀?00×雙抗母液，青霉素的含量為10KU/ml， 鏈霉素的含量為10mg/ml。消化液：常用0.25％胰蛋白酶，使細(xì)胞脫離組織或容器壁， 用含血清培養(yǎng)液中止其活性 。清洗液：生理鹽水或磷酸緩沖液。,配制各種溶液均需使用高

5、純度的去離子水,培養(yǎng)容器,醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn),用于防止微生物進(jìn)入組織、細(xì)胞或其它無菌范圍的操作技術(shù)稱為無菌操作技術(shù)。如外科手術(shù)需防止細(xì)菌進(jìn)入傷口。在各種生物實(shí)驗(yàn)中,為了防止微生物地生長和繁殖影響實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行,也要在無菌的環(huán)境下進(jìn)行。,無菌操作技術(shù),醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn),用品滅菌-滅菌技術(shù)操作環(huán)節(jié)保持無菌,滅菌技術(shù),醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn),滅菌技術(shù),操作方法,適用范圍,設(shè)備用品,滅菌液擦拭,滅菌液擦拭,金屬、玻璃、塑料器械，容器外壁。,酒精、升

6、汞等,高溫灼燒,火焰輕微灼燒,耐高溫器械-金屬、玻璃器械用品，玻璃容器瓶口等。,酒精燈等,紫外線滅菌,紫外線照射15-30min,各種用品的簡單滅菌。操作人員遠(yuǎn)離。,紫外燈，穿透能力弱,過濾除菌,過濾,有機(jī)溶液試劑,過濾裝置和濾膜,高溫高壓滅菌,121℃，壓力15磅(1.05kg/cm)，滅菌15-30 min。,耐高溫高壓玻璃、金屬、塑料器械用品，無機(jī)溶液等。,高溫高壓滅菌鍋,醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn),醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn),醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

7、,醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn),醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn),醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn),,直接或間接接觸細(xì)胞的用品要保持無菌。,醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn),器械用品濃酸浸泡過夜，自來水沖洗10次以上，蒸餾水洗三遍以上完成清洗，高壓滅菌。溶液試劑滅菌。,紫外線照射無菌間、超凈臺、實(shí)驗(yàn)服15-20min通風(fēng)去除O3 滅菌水擦拭試驗(yàn)臺。,洗手，酒精棉球擦拭雙手。穿著實(shí)驗(yàn)服。佩戴口罩和頭套。,點(diǎn)燃酒精燈，火焰消毒，火焰周圍操作。材料進(jìn)出超凈臺密封并重新消毒。防止交

8、叉污染。,,,,超凈工作臺,醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn),三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,乳鼠肺組織細(xì)胞原代培養(yǎng),醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn),處死乳鼠（窒息法）→75%酒精消毒2-3s（燒杯中）→轉(zhuǎn)移到超凈臺內(nèi)，解剖取肺（培養(yǎng)皿）→PBS洗滌→初剪→ PBS洗滌→轉(zhuǎn)移到青霉素瓶→ 剪碎→加5-8倍體積胰酶 → 37 ℃消化20min→加1-2ml培養(yǎng)液終止消化→吹打混勻→靜置3-5min→ 取上清轉(zhuǎn)入離心管中→配平→ 1000rpm離心5min（離心機(jī)的使用）→棄上清→加

9、5ml培養(yǎng)液→吹打混勻→轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶（擰緊蓋子后，松半圈）→放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)→24h后觀察。,三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,乳鼠肺組織細(xì)胞原代培養(yǎng),醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn),到培養(yǎng)室→洗手→帶帽子和口罩→坐在超凈工作臺旁→酒精棉球擦拭雙手→點(diǎn)燃酒精燈→分發(fā)器材和動(dòng)物→按步驟操作,肺,肺,,,醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn),醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn),,操作前要洗手，進(jìn)入超凈臺后手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試。點(diǎn)燃酒精燈，操作在火焰附近進(jìn)行，耐熱物品要經(jīng)

10、常在火焰上燒灼，金屬器械燒灼時(shí)間不能太長，并冷卻后才能夾取組織；所有的操作都應(yīng)該在超凈工作臺中酒精燈火焰的旁邊進(jìn)行；吸取不同的液體要換用不同的吸管（防止交叉污染）；操作過程中，動(dòng)作要敏捷，但又不能太快，以防空氣流動(dòng)，增加污染機(jī)會(huì)。不能用手觸及器皿的消毒部位；消化和離心時(shí)要先加蓋才能拿出去；離心后需用酒精棉擦洗后才開蓋；離心機(jī)使用前，對稱的兩個(gè)離心管必須配平后才可離心；所有的垃圾、廢液等均放入大燒杯中，保持臺面整潔。,四、本實(shí)

11、驗(yàn)注意事項(xiàng),可以比較經(jīng)濟(jì)地、大量地提供生物性狀相同的細(xì)胞作為研究對象。由于細(xì)胞處于體外培養(yǎng)環(huán)境中，便于用各種技術(shù)方法研究和觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的變化。由于細(xì)胞在體外培養(yǎng)環(huán)境中可以長期地存活和傳代，因而便于研究和觀察細(xì)胞遺傳性的改變。由于人工培養(yǎng)條件易于改變，能嚴(yán)格控制并進(jìn)行單因素分析，所以便于用各種物理的、化學(xué)的或生物的外界因素來研究細(xì)胞生命活動(dòng)的規(guī)律。細(xì)胞培養(yǎng)是闡述生命現(xiàn)象、發(fā)病機(jī)理和篩選藥物的重要手段；是細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)