兔同種異體半月板移植的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、半月板是正常膝關(guān)節(jié)的重要組成部分，它填充于脛骨平臺(tái)和股骨髁之間的空隙，能吸收震蕩、傳導(dǎo)負(fù)荷，并在輔助穩(wěn)定和關(guān)節(jié)潤(rùn)滑、營(yíng)養(yǎng)等方面都起著至關(guān)重要的作用。半月板嚴(yán)重?fù)p傷或切除后，半月板對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)作用喪失，關(guān)節(jié)軟骨的退變加速，導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)定和骨關(guān)節(jié)炎。 半月板外周三分之一由來(lái)自膝關(guān)節(jié)動(dòng)脈網(wǎng)的終末支供血，輕度損傷后有自行愈合的可能；而其內(nèi)側(cè)三分之二無(wú)血管終支供血，損傷后一般不能自愈，多需手術(shù)治療。半月板損傷的傳統(tǒng)治療為半月板縫合或

2、半月板切除術(shù)，遠(yuǎn)期隨訪發(fā)現(xiàn)手術(shù)后仍會(huì)較早出現(xiàn)膝關(guān)節(jié)軟骨退變征象，對(duì)半月板缺失或嚴(yán)重?fù)p傷無(wú)法縫合者，新近的觀點(diǎn)是需重建半月板以防止骨關(guān)節(jié)炎。 同種異體半月板移植因其療效肯定已經(jīng)逐漸被學(xué)者們所認(rèn)同，在進(jìn)行了大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的同時(shí)，正越來(lái)越多的應(yīng)用于臨床。研究表明，異體半月板移植后，半月板內(nèi)的供體源纖維軟骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞漸漸為受體源纖維軟骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞所替代。在受體來(lái)源的纖維軟骨細(xì)胞逐漸增加及半月板超微結(jié)構(gòu)的再塑形階段，半月板生物力

3、學(xué)結(jié)構(gòu)支架比正常半月板脆弱，在不恰當(dāng)應(yīng)力的作用下，極易退變或損傷撕裂，導(dǎo)致移植失敗，而長(zhǎng)時(shí)間的制動(dòng)又大大增加了術(shù)后膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率。因此，如何促進(jìn)異體半月板移植后的超微結(jié)構(gòu)重建，從而改善異體半月板移植的預(yù)后，進(jìn)而有效減緩或阻止臨近關(guān)節(jié)的退變，是當(dāng)前該領(lǐng)域繼續(xù)研究的重點(diǎn)。異體半月板移植后局部的血管重建與細(xì)胞分裂增殖至關(guān)重要。尤其是后者，自體間充質(zhì)細(xì)胞能否有效的分化為有功能活性的纖維軟骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞并分裂增殖，直接決定了移植半月

4、板的重建；胰島素可通過(guò)胰島素生長(zhǎng)因子受體而介導(dǎo)多種生物學(xué)功能，除調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝過(guò)程外，還能促進(jìn)軟骨細(xì)胞等多種細(xì)胞的增殖，而且胰島素經(jīng)濟(jì)易得，很具有臨床實(shí)用價(jià)值。 本研究擬建立兔同種異體半月板移植的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型；并通過(guò)比較單純同種異體半月板移植、半月板移植并添加胰島素兩種不同情況下移植半月板的轉(zhuǎn)歸，從而探討胰島素能否改善同種異體半月板移植的預(yù)后，并為下一步應(yīng)用于臨床奠定理論基礎(chǔ)。該方面的研究至今未見(jiàn)報(bào)道。 材料與方法

5、 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：30只2.5-3kg雌性中國(guó)家兔，平均月齡18周。 2.半月板制備與保存： 無(wú)菌手術(shù)取出10只供體兔雙膝內(nèi)側(cè)半月板共20個(gè)，編號(hào)，放入無(wú)菌瓶，置入-80℃冰箱保存2周待用。 3.新鮮凍存同種異體半月板移植： 將20個(gè)新鮮凍存半月板隨即分成A、B兩組，每組10個(gè)，其中A組術(shù)前于室溫下在36℃等張生理鹽水中快速解凍，B組于相同條件下解凍并加入適量胰島素，濃度為0.1U/ml，浸泡解凍時(shí)間約1

6、小時(shí)。 選取與異體半月板供體兔體重接近的兔，每組10只，在切除相應(yīng)內(nèi)側(cè)半月板后，即分別行單純內(nèi)側(cè)半月板移植、內(nèi)側(cè)半月板移植并加入胰島素。 術(shù)畢每籠兩只飼養(yǎng)，籠中隨意活動(dòng)，并于B組兔患膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入1％胰島素0.3m1，每周一次，連續(xù)5周。 4.于術(shù)后第8周末用空氣栓塞法處死所有實(shí)驗(yàn)兔。離斷膝關(guān)節(jié)上下部分后，打開(kāi)關(guān)節(jié)，大體觀察半月板及關(guān)節(jié)內(nèi)結(jié)構(gòu)，10％甲醛固定、切片、石蠟固定，分別用蘇木素、伊紅染色及免疫組化切片染

7、色，觀察結(jié)果。 結(jié)果 1.大體觀察：術(shù)后8周所有半月板移植個(gè)體，肉眼下觀察均可見(jiàn)移植半月板與外周關(guān)節(jié)囊和滑膜良好愈著，個(gè)別可見(jiàn)半月板后角未固定于脛骨平臺(tái)后緣，但均與周?chē)P(guān)節(jié)囊愈著良好，半月板位置基本正常，A組中3例，B組中2例可見(jiàn)移植半月板體部輕度萎縮；滑膜輕度充血；關(guān)節(jié)腔內(nèi)無(wú)明顯積液；部分膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)脛骨平臺(tái)和股骨內(nèi)髁表面輕度粗糙；對(duì)移植半月板及關(guān)節(jié)內(nèi)部大體情況進(jìn)行評(píng)分后比較，兩組之間有顯著性差異。 2.組織學(xué)觀

8、察，移植后第8周，光鏡下顯示：移植半月板表面大多有高度血管化的滑膜組織覆蓋及細(xì)胞增殖，纖維軟骨樣細(xì)胞由周邊逐漸長(zhǎng)入移植半月板中央，半月板內(nèi)部基本上仍為無(wú)細(xì)胞核組織或胞核淡紅染，顯示為無(wú)活力細(xì)胞；半月板中央部膠原纖維排列稍紊亂，呈波浪狀，較稀疏，而周邊新生的結(jié)締組織中，膠原纖維排列明顯較規(guī)則；對(duì)移植半月板HE染色結(jié)果評(píng)分后比較，兩組之間有顯著性差異。 3.免疫組化切片示：兩組移植半月板內(nèi)新生的軟骨細(xì)胞均有TIMP-1表達(dá)，經(jīng)圖象處

9、理軟件分析后得到兩組細(xì)胞染色的灰度值，SPSS 10.0軟件分析比較示兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論 1.本課題成功構(gòu)建了兔同種異體半月板移植模型，移植異體半月板采用新鮮凍存的方法保存，移植方法采用單純將半月板周邊與關(guān)節(jié)囊縫合的方法，結(jié)果顯示縫合后均可達(dá)到良好愈合。 2.HE切片染色顯示，移植半月板有新生細(xì)胞從周邊向中央長(zhǎng)入，并由滑膜細(xì)胞逐漸化生為纖維軟骨細(xì)胞；TIMP-1定位于細(xì)胞漿，是維持軟骨基質(zhì)正常代謝、