環(huán)境氧化應(yīng)激誘發(fā)蛋白質(zhì)(多肽)氧化損傷評價新方法的研究.pdf

1、環(huán)境問題是當(dāng)前最重要的全球性問題之一。環(huán)境中的各種污染物對生態(tài)環(huán)境造成破壞的同時，也嚴(yán)重威脅著人類的健康與生存。外源性環(huán)境污染物可以通過呼吸道吸入、由食物鏈經(jīng)消化道攝入和皮膚接觸等渠道進入生物體內(nèi)，誘發(fā)機體發(fā)生環(huán)境氧化應(yīng)激(氧化活性物質(zhì)(ROS)的過量表達)，造成DNA/RNA、蛋白質(zhì)、多肽、脂類等生物分子的氧化損傷。現(xiàn)已證明環(huán)境氧化應(yīng)激與諸多疾病有關(guān)，并且是引起疾病第二位的原因。因此，研究環(huán)境污染物誘發(fā)機體功能生物大分子的氧化損傷機理

2、，建立其快速、靈敏評價方法有助于人們了解環(huán)境污染物的致病機理和全面評價污染物毒性，為相關(guān)疾病的早期診斷、預(yù)防和治療提供科學(xué)依據(jù)。
　　 蛋白質(zhì)是生物體各種功能的直接執(zhí)行者。當(dāng)其暴露于氧化應(yīng)激的環(huán)境中時，ROS能夠誘發(fā)機體蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的氧化性損傷和功能的消弱/喪失，進而導(dǎo)致諸多疾病的發(fā)生。因此，研究環(huán)境污染物對蛋白質(zhì)的氧化損傷作用一直是環(huán)境污染與健康領(lǐng)域的熱門課題。
　　 本論文以分析化學(xué)、環(huán)境毒理學(xué)為背景，結(jié)合電化學(xué)、

3、高效液相色譜、質(zhì)譜等實驗技術(shù)模擬研究了環(huán)境氧化應(yīng)激誘發(fā)氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)的氧化損傷機理，并對氧化損傷的評價方法進行了探討。論文主要包括以下四部分：
　　 第一章闡述了各類污染物誘發(fā)環(huán)境氧化應(yīng)激的途徑；歸納了環(huán)境氧化應(yīng)激致氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)生物分子損傷的類型以及蛋白質(zhì)氧化損傷與相關(guān)疾病的相關(guān)關(guān)系；介紹了蛋白質(zhì)氧化損傷的分析與評價技術(shù)，蛋白質(zhì)氧化損傷研究進展。在文獻綜述的基礎(chǔ)上分析了目前研究中存在的問題，提出了基于電化學(xué)循環(huán)伏安

4、、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在模擬研究環(huán)境氧化應(yīng)激誘發(fā)氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)的氧化損傷機理的評價方法。
　　 第二章選擇氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)作為電化學(xué)氧化損傷的靶分子，從分子水平上模擬研究其相應(yīng)的界面氧化損傷機理，為機體蛋白質(zhì)氧化損傷機理的深入研究提供了參考。
　　 1)利用電化學(xué)循環(huán)伏安技術(shù)模擬研究了胱氨酸、半胱氨酸在裸金電極上的氧化還原行為，探討了半胱氨酸的界面氧化損傷機理。研究結(jié)果表明(以金電極表面氧化為例)，正掃過程中

5、半胱氨酸有兩個特征氧化峰，0.65V附近的氧化峰對應(yīng)于半胱氨酸氧化生成胱氨酸，0.85V附近的氧化峰對應(yīng)于胱氨酸、半胱氨酸氧化生成CySOxH(x=2、3)；負(fù)掃過程半胱氨酸與多晶金形成Au-S鍵(該過程為失電子過程)，還原峰電流明顯降低且隨半胱氨酸濃度增加而逐步下陷。在此基礎(chǔ)上，研究了體系除氧、酸堿度、掃描速率、溫度等因素對半胱氨酸在電極上發(fā)生電化學(xué)氧化損傷過程的影響。該結(jié)果對于全面認(rèn)識氧化應(yīng)激條件下含硫多肽、蛋白質(zhì)在生物膜表面的氧化

6、損傷機理及損傷修復(fù)提供了新的思路與方法。
　　 2)利用電化學(xué)循環(huán)伏安法模擬研究了還原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽在金電極上的界面氧化還原行為。相對位阻較小的半胱氨酸、胱氨酸在金電極表面氧化過程，空間位阻比較大的還原型谷胱甘肽并未發(fā)生兩步的氧化過程，而是直接氧化生成GSOxH(難以生成氧化性的GSSG)。上述現(xiàn)象與普遍報道的GSH在環(huán)境氧化應(yīng)激條件下生成GSSG的情況并不一致。這可能是由于GSH游離巰基兩側(cè)各自存在的一個氨基酸，使

7、得巰基在電極表面的氧化過程存在明顯的空間位阻作用。游離巰基之間的距離較大，無法形成二硫鍵(S-S)，因而只能生成GSOxH。該過程一定程度上類似于生物體線粒體膜、細(xì)胞膜等部位上發(fā)生的生物功能分子的氧化損傷過程，因而對于生物體膜上氧化損傷的研究，乃至相關(guān)疾病的研究都具有重要的意義。
　　 3)利用電化學(xué)循環(huán)伏安技術(shù)研究了牛胰島素在裸金電極上的氧化還原行為。通過與磷酸鹽緩沖液、胱氨酸和胰島素所含的其他氨基酸的電化學(xué)特征比較，胰島素的

8、電化學(xué)氧化損傷機理被詳細(xì)闡明：胰島素分子中的二硫鍵是其潛在的損傷位點并且其氧化產(chǎn)物為次磺酸(RSOH)、亞磺酸(RSO2H)以及磺酸(RSO2H)類化合物，但相對胱氨酸而言，由于空間位阻作用胰島素需要更為嚴(yán)苛的條件才能實現(xiàn)氧化；由于胰島素分子中二硫鍵S-SCYS6A，CYS11A和S-SCYS20A，CYS19B具有較小的溶劑接觸面積而難以氧化。因此，該研究條件下胰島素的主要氧化位點應(yīng)為二硫鍵S-SCys7A-Cys7B。
　　

9、 第三章選擇多肽、蛋白質(zhì)氧化損傷生成的羥基、亞砜產(chǎn)物作為準(zhǔn)確表述蛋白質(zhì)(多肽)氧化損傷位點、損傷程度的生物標(biāo)記物，并利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)及質(zhì)譜碎片技術(shù)(LC-MS、LC-MS/MS)作為主要檢測技術(shù)，建立其定性、定量研究的新方法。
　　 1)利用液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)、二級質(zhì)譜(MS/MS)等技術(shù)研究了UV/H2O2誘發(fā)多肽氧化損傷位點、損傷程度及損傷機理，并探討了以多肽氧化損傷位點作為氧化損傷標(biāo)志物的可行性。研究證

10、實UV/H2O2(模擬環(huán)境氧化應(yīng)激條件)對目標(biāo)多肽中的FMRF存在明顯的氧化損傷且損傷程度與時間正相關(guān)，并且LC-MS技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)損傷產(chǎn)物與未損傷多肽的快速分離和準(zhǔn)確鑒定。因此，以多肽氧化損傷產(chǎn)物作為直接評價氧化損傷的新型標(biāo)記物具有潛在優(yōu)勢。本研究不僅拓展了多肽和蛋白質(zhì)氧化損傷生物標(biāo)記物的范圍，也為闡明多肽等功能分子氧化損傷位點、相應(yīng)位點的氧化損傷程度以及氧化損傷機理的研究提了供一種準(zhǔn)確高效評價的新方法。
　　 2)利用高效液相

11、色譜和串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)建立了以靶蛋白細(xì)胞色素C氧化損傷位點和損傷程度作為氧化損傷標(biāo)志物評價其氧化損傷機理的新策略。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC/MS)和多肽指紋圖譜鑒定(MS/MS)技術(shù)分別被用于胰蛋白酶解多肽的分離檢測和UV/H2O2氧化損傷位點的定位研究。結(jié)合LC/MS和MS/MS實驗結(jié)果，可以確定酶解多肽C14AQC(heme)HTVEK22、C14AQCHTVEK22、E60ETLMEYLENPKK73、M80IFAGIK86、M80I

12、FAGIKK87中的Cys14、Cys17、Met65、Met80殘基是主要的氧化損傷位點。上述位點氧化損傷程度與氧化時間的正相關(guān)性證實以蛋白質(zhì)氧化損傷產(chǎn)物作為評價其氧化損傷機理的可行性。
　　 3)利用60Co-γ射線輻照牛血紅細(xì)胞方式，模擬了環(huán)境氧化應(yīng)激條件下過量表達的ROS對牛血紅蛋白的氧化損傷作用，通過高效液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)建立了胞內(nèi)血紅蛋白氧化損傷位點和損傷程度的評價方法。通過比較損傷前后血紅蛋白酶解的總離子色譜圖

13、及相應(yīng)組分的MS/MS數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)靶分子的氧化損傷位點主要是部分暴露的氨基酸殘基(例如α-Phe36、β-Met1、β-Trp14)。氧化產(chǎn)物的定量分析表明，各損傷位點的氧化程度與氧化劑量正相關(guān)且受到氨基酸殘基類型和暴露程度控制。與傳統(tǒng)的蛋白羰基標(biāo)記方法相比，本文所采用的方法為體外模擬條件下以及“體內(nèi)”氧化應(yīng)激實際存在時蛋白氧化損傷評價提供有效的技術(shù)支持。
　　 第四章最后對本論文的各研究部分進行了總結(jié)，并分析了蛋白、多肽等靶分子