ⅱ型膠原酶加壓灌流提高成年大鼠心肌細(xì)胞分離效率

1、1Ⅱ型膠原酶加壓灌流提高成年大鼠心肌細(xì)胞分離效率型膠原酶加壓灌流提高成年大鼠心肌細(xì)胞分離效率李德，唐兵，楊大春，楊永健成都軍區(qū)總醫(yī)院心內(nèi)科（成都610083）摘要：目的摘要：目的探討效率更高的成熟心肌細(xì)胞分離方法。方法方法采用Ⅱ型膠原酶升主動(dòng)脈逆行灌流法分離成年大鼠心肌細(xì)胞。對(duì)照組采用Langendff裝置灌流；實(shí)驗(yàn)組在Langendff裝置基礎(chǔ)上加壓勻速灌流。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并計(jì)算桿狀細(xì)胞比率及產(chǎn)量；通過臺(tái)盼藍(lán)染色和局部場(chǎng)

2、剌激評(píng)價(jià)心肌細(xì)胞活性。結(jié)果結(jié)果分離即刻，實(shí)驗(yàn)組桿狀細(xì)胞比率顯著高于對(duì)照組（90.34.4%νs53.45.2%，p0.01）；實(shí)驗(yàn)組活細(xì)胞產(chǎn)量也顯著高于對(duì)照組[（3.60.7）107νs（1.90.6）107，p0.01]。復(fù)鈣過程中，實(shí)驗(yàn)組發(fā)生自發(fā)性收縮的細(xì)胞比率及變圓細(xì)胞比率均明顯低于對(duì)照組（10.42.1%νs18.94.5%，p0.01；5.31.3%νs8.61.7%，p0.05）。實(shí)驗(yàn)組臺(tái)盼藍(lán)染色陰性的桿狀細(xì)胞比率和局部場(chǎng)剌

3、激條件下收縮細(xì)胞比率明顯高于對(duì)照組（95.38.2%νs90.69.8%，p0.05；92.27.6%νs856.4%，p0.01）。結(jié)論結(jié)論Ⅱ型膠原酶加壓灌流可獲得高產(chǎn)量、高活性的心肌細(xì)胞，提高了成熟心肌細(xì)胞的分離效率。關(guān)鍵詞：關(guān)鍵詞：大鼠；心肌細(xì)胞；細(xì)胞分離PressurizingperfusionwithcollagenasetypeⅡimprovetheisolationefficacyofadultratcardiomyocy

4、tesLIDeTANGBingYANGDachunYANGYongjian(DepartmentofCardiologyChengduMilitaryGeneralHospitalChengdu610083China.)Abstract:ObjectiveToinvestigateameeffectivemethodofisolationofadultratcardiomyocytes.MethodsCardiacmyocytesfro

5、mSDratswereisolatedbycollagenasetypeⅡperfusionincontrolgroupbypressurizingperfusioninexperimentalgroup.Thecardiomyocytesweremphologicallyobservedwithopticalmicroscopeevaluatedbytrypanbluedyingfieldstimulation.ResultsTher

6、atioofrodshapedcellsyieldofviablecellsperratweresignificantlyhigherinexperimentalgroupthanincontrolgroup[90.34.4%νs53.45.2%，p0.01（3.60.7）107νs（1.90.6）107，p0.01].DuringrecalcificationTheincidenceofspontaneouscontractionde

7、fmationweresignificantlylowerinexperimentalgroupthanincontrolgroup（10.42.1%νs18.94.5%，p0.01；5.31.3%νs8.61.7%，p0.05）.Theratiooftrypanbluedyingnegativecellscellswithcontractileunderfieldstimulationweresignificantlyhigherin

8、experimentalgroupthanincontrolgroupalso（95.38.2%νs90.69.8%，p0.05；92.27.6%νs856.4%，p0.01）.ConclusionAdultratcardiomyocytescanbeisolatedmeefficientlybycollagenasetypeⅡpressurizingperfusion.Keywds:ratcardiomyocytescellsepar

9、ation心肌細(xì)胞已成為研究心肌結(jié)構(gòu)、代謝、功能、病理生理、發(fā)病其機(jī)制及心肌疾病治療的重要工具。分離和培養(yǎng)胚胎期或新生期動(dòng)物心肌細(xì)胞（未成熟心肌細(xì)胞）的實(shí)驗(yàn)方法較為成熟，而成年動(dòng)物心肌細(xì)胞（成熟心肌細(xì)胞）的分離和培養(yǎng)較為困難。未成熟心肌細(xì)胞無論在功能還是在結(jié)構(gòu)等方面與成熟的心肌細(xì)胞相比均存在差異，因此，來自于未成熟心肌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)論難于推論于成熟心肌細(xì)胞，應(yīng)用成熟心肌細(xì)胞進(jìn)行心臟疾病發(fā)病機(jī)制和治療研究成為心血管病領(lǐng)域的重要課題[1]。但

10、由于成熟心肌細(xì)胞分離和培養(yǎng)較困難，技術(shù)31.5心肌細(xì)胞梯度復(fù)鈣加入0.18mMCaCl2臺(tái)氏液10ml重懸細(xì)胞，靜置10分鐘，細(xì)胞自然沉降；吸除上清5ml，再加入1.8mMCaCl2臺(tái)氏液5ml重懸細(xì)胞，靜置10分鐘，細(xì)胞自然沉降，去上清；加入1.8mMCaCl2臺(tái)氏液10ml重懸細(xì)胞，靜置10分鐘，細(xì)胞自然沉降。1.6心肌細(xì)胞產(chǎn)量及活性檢測(cè)①在倒置顯微鏡下用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算每個(gè)心臟細(xì)胞產(chǎn)量。細(xì)胞數(shù)毫升原液=（4個(gè)大格細(xì)胞數(shù)

11、之和4)104稀釋倍數(shù)。②臺(tái)盼藍(lán)染色：用0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色，臺(tái)盼藍(lán)拒染的細(xì)胞為活的心肌細(xì)胞，計(jì)算臺(tái)盼藍(lán)染色陰性的桿狀（包括矩形）細(xì)胞占總桿狀細(xì)胞數(shù)的百分比。③場(chǎng)剌激觀察收縮細(xì)胞比率：將心肌細(xì)胞加入檢測(cè)皿，給予局部場(chǎng)刺激（頻率1Hz，電壓15V，脈寬2ms），在倒置顯微鏡下計(jì)算收縮細(xì)胞比率。1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)以xs表示，組間比較用t檢驗(yàn)。2結(jié)果結(jié)果2.1心肌細(xì)胞的形態(tài)及產(chǎn)量在倒置顯微鏡下觀察，分離即刻的心肌細(xì)胞主要有4種形態(tài)：呈桿狀、矩