用基因工程的基本操作程序

1、陌陌個(gè)性簽名女生文藝控　　1、從云端墜落卻看見(jiàn)整片天空?！　?、Abstruse eyes， a smile in the clear reflections.深邃的眼眸，倒影出笑容的清澈。　　3、左心房旳溫暖，是沵最耀眼旳光芒。　　4、炫麗的彩虹，永遠(yuǎn)都在雨過(guò)天晴后?！　?、風(fēng)吹起如花般破碎的流年，而你的笑容搖晃搖晃，成為我命途中最美的點(diǎn)綴，看天、看雪、看季節(jié)深深的暗影?！　?、oО手牽手，一起走進(jìn)結(jié)婚禮堂，讓上帝見(jiàn)證我們的愛(ài)情＇★.

2、．　　7、我們的愛(ài)，不求生生世世，但求今生今世?！　?、夕陽(yáng)西下一抹金色映灑滿整個(gè)海面，這一刻天和地不再是兩個(gè)個(gè)體?！　?、╘\＞他和她愛(ài)德很美很浪漫就像●/玫瑰花　　10、夏天棄了西瓜愛(ài)上了空調(diào)　　11、我給你一滴眼淚，你有沒(méi)有看到我心中全部的海洋。　　12、詮釋流星的幸福，記錄你我間追逐得ッ雨季~~　　13、伈、為 袮 滴 成 琥 珀， 冷 卻 以 后、 千 哖 后 萬(wàn) 哖 后、 愛(ài) 通 透 依 舊 。　　14、摩天輪頂端的幸福..

3、..　　15、午后的微光透過(guò)窗簾的間隙投射在泛黃的信紙上，似一塊橘色的琥珀?！　?6、心隨你動(dòng)，時(shí)間因你而靜止。,基因工程的基本操作程序,,基因工程基本操作的包括幾個(gè)步驟？核心是？,,,,,基因工程基本操作的四個(gè)步驟,1、目的基因的獲取,2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建,3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,4、目的基因的檢測(cè)與鑒定,核心,一、目的基因的獲取,從基因文庫(kù)中獲取,利用PCR技術(shù)擴(kuò)增,人工合成,,閱讀教材回答：1、目的基因的來(lái)源2、目的基

4、因的種類(lèi)3、獲取目的基因常用的方法,生物體直接分離,,從基因文庫(kù)中獲得目的基因,1、什么是基因文庫(kù)？包括的種類(lèi)有哪些？2、怎樣從基因文庫(kù)中得到我們所需的目的基因呢？3、如何構(gòu)建基因文庫(kù)？構(gòu)建方法包括哪些？4、cDNA文庫(kù)和基因組文庫(kù)有何不同？嘗試分析出現(xiàn)這些區(qū)別的原因？,①不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA，不能 編碼蛋白質(zhì)。,：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使RNA，能 編碼蛋白質(zhì),編碼區(qū),非編碼區(qū),原核細(xì)胞的 基因結(jié)構(gòu),,,②有調(diào)控遺傳信息

5、表達(dá)的核 苷酸序列.包括啟動(dòng)子和終止子,,,,,,,,,非編碼區(qū),,非編碼區(qū),編碼區(qū),編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,啟動(dòng)子,終止子,,,,,,,,,2、真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu),,,,,,編碼區(qū),與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn),,,內(nèi)含子,外顯子,能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子,不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子,啟動(dòng)子,終止子,編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,內(nèi)含子：,外顯子：,非編碼序列：,包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子,合作探究：,嘗試畫(huà)出真核生物基因表達(dá)的過(guò)程,

6、,,,DNA,,3、原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較,思考,1、編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核細(xì)胞與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)一樣長(zhǎng)嗎？2、cDNA是怎樣獲得的？現(xiàn)在你能理解cDNA文庫(kù)的這些特點(diǎn)了嗎？想一想，再與同學(xué)交流，還有哪些問(wèn)題不能理解？,連續(xù),不連續(xù),編碼區(qū),非編碼,基因組DNA文庫(kù),cDNA文庫(kù),基因組DNA文庫(kù)與cDNA文庫(kù)的比較,①基因組文庫(kù)的構(gòu)建,（2）基因文庫(kù)的構(gòu)建方法,通過(guò)對(duì)受體菌的培養(yǎng)而儲(chǔ)存基因,② cDNA文庫(kù)的構(gòu)

7、建-----反轉(zhuǎn)錄法： 以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，與載體連接后儲(chǔ)存在一個(gè)受體菌群中，這個(gè)受體菌群就叫這種生物的cDNA文庫(kù),比較基因組文庫(kù)和cDNA文庫(kù),大,小,有,無(wú),有,無(wú),全部基因,部分基因,部分基因可以,可以,,,怎樣從基因文庫(kù)中得到我們所需的目的基因呢?,依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列 基因的功能 基因在染色體上的

8、位置 基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA 基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性,④從基因文庫(kù)中得到目的基因的方法,1、構(gòu)建基因組DNA文庫(kù)時(shí)，首先應(yīng)分離細(xì)胞的A、染色體DNA   B、線粒體DNAC、總mRNA   D、tRNA,2、目的基因可從基因文庫(kù)中獲得，下列有關(guān)基因文庫(kù)的描述正確的是A、某生物的全套基因就是一個(gè)基因文庫(kù)B、將含有某種生物不同的許多DNA片段，導(dǎo)入某

9、個(gè)生物體內(nèi)，則這個(gè)生物就是一個(gè)基因文庫(kù)C、含有一種生物所有基因的基因文庫(kù)叫做基因組文庫(kù)D、含有一種生物的一部分基因的基因文庫(kù)叫cDNA文庫(kù),A,C,2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因,閱讀10頁(yè)最后一段，結(jié)合圖1-8回答：1、PCR的全稱(chēng)2、概念3、原理4、前提5、條件6、過(guò)程,PCR技術(shù)—多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),原理：前提：條件：,PCR擴(kuò)增儀,DNA雙鏈復(fù)制的基本原理,一段已知目的基因的核苷酸序列,原料：四種脫氧核苷酸,

10、一對(duì)引物（引物1、引物2）,酶：熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶）,模板：DNA的兩條鏈為模板,能量：溫度控制,：以__ ___方式擴(kuò)增， 即___ _（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）,指數(shù),2n,方式,使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬(wàn)倍地?cái)U(kuò)增,結(jié)果,過(guò)程,變性、退火、延伸三步曲,變性：加熱至90～95℃雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA退火：冷卻至55～60℃部分引物與模板的單鏈DNA的特定互補(bǔ)部位相配對(duì)和結(jié)合延伸：加熱至70～75℃以目的

11、基因?yàn)槟０?，在Taq酶的作用下合成互補(bǔ)的新DNA鏈,重復(fù)循環(huán),PCR技術(shù)擴(kuò)增與DNA復(fù)制的比較,堿基互補(bǔ)配對(duì),四種脫氧核苷酸,模板、能量、酶,高溫下變性解旋,解旋酶催化,體外復(fù)制(PCR擴(kuò)增儀內(nèi)),主要在細(xì)胞核內(nèi),熱穩(wěn)定的DNA聚合酶（Taq酶）,大量的DNA片段,形成整個(gè)DNA分子,解旋酶、普通的DNA聚合酶等,3、人工合成—化學(xué)合成法,DNA合成儀,,如果基因比較小，核苷酸序列又已知，也可以通過(guò)DNA合成儀用化學(xué)方法直接人工合成。,

12、1、在遺傳工程中，若有一個(gè)控制有利性狀的DNA分子片段為ATGTG／TACAC，要使其數(shù)量增多，可用PCR技術(shù)進(jìn)行人工復(fù)制，復(fù)制時(shí)應(yīng)給予的條件是 ①雙鏈DNA分子為模板 ②ATGTG或TACAC模板鏈 ③四種脫氧核苷酸 ④四種核苷酸 ⑤DNA聚合酶 ⑥熱穩(wěn)定DNA聚合酶⑦引物 ⑧溫度變化 ⑨恒溫A．①③④⑦⑨ B．①④⑥⑦⑧C．②⑤⑥⑦⑨ D．①③⑥⑦⑧,D,2、下列獲取目的基因的方法中需要模板鏈的是①?gòu)幕蛭膸?kù)中

13、獲取目的基因 ②利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因 ③反轉(zhuǎn)錄法 ④通過(guò)DNA合成儀利用化學(xué)方法人工合成A．①②③④ B．①②③ C．②③④ D．②③,D,1）以下說(shuō)法正確的是 （ ） A、所有的限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列 B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運(yùn)載體 C、運(yùn)載體必須具備的條件之一是：具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接 D、基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出

14、來(lái),C,3）有關(guān)基因工程的敘述中，錯(cuò)誤的是（ ） A、DNA連接酶將黏性末端的堿基對(duì)連接起來(lái) B、 限制性內(nèi)切酶用于目的基因的獲得 C、目的基因須由運(yùn)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞 D、 人工合成目的基因不用限制性內(nèi)切酶,A,4）有關(guān)基因工程的敘述正確的是 （ ） A、限制酶只在獲得目的基因時(shí)才用 B、重組質(zhì)粒的形成在細(xì)胞內(nèi)完成 C

15、、質(zhì)粒都可作為運(yùn)載體 D、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料,D,5）基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)施工的。在基因操作的基本步驟中，不進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)的步驟是 （ ） A、人工合成目的基因 B、目的基因與運(yùn)載體結(jié)合 C、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 D、目的基因的檢測(cè)和

16、表達(dá),C,二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建 ——基因工程的核心,1、目的：所需結(jié)構(gòu)：,使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。,它們各自的作用是什么?,2、基因表達(dá)載體的組成：,、 、 、 等,它們各自的作用是什么?,,質(zhì)粒,DNA分子,,限制酶處理,,,一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端,兩個(gè)切口獲得目的基因,DNA連接酶,重組DNA分子（

17、重組質(zhì)粒）,,同一種,3.過(guò)程:,思考：作為基因工程表達(dá)載體，只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎？為什么？（P15）,不可以。 因?yàn)槟康幕蛟诒磉_(dá)載體中得到表達(dá)并發(fā)揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。 必須構(gòu)建上述元件的主要理由是：,（1） 生物之間進(jìn)行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動(dòng)子才能比較有利于基因的表達(dá)；,（2） 通過(guò)cDNA文庫(kù)獲得的目的基因沒(méi)有啟動(dòng)子，只將編碼序列導(dǎo)入受體生物中無(wú)

18、法轉(zhuǎn)錄；,（3） 目的基因是否導(dǎo)入受體生物中需要有篩選標(biāo)記；,（4） 為了增強(qiáng)目的基因的表達(dá)水平，往往還要增加一些其他調(diào)控元件，如增強(qiáng)子（增強(qiáng)基因啟動(dòng)子工作效率的順式作用序列，能夠在相對(duì)于啟動(dòng)子的任何方向和任何位置(上游或下游)上都發(fā)揮作用。）等；,（5） 有時(shí)需要確定目的基因表達(dá)的產(chǎn)物存在于細(xì)胞的什么部位，往往要加上可以標(biāo)識(shí)存在部位的基因（或做成目的基因與標(biāo)識(shí)基因的融合基因），如綠色熒光蛋白基因等。,①載體與表達(dá)載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)

19、記基因和復(fù)制原點(diǎn)兩部分DNA片段。表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動(dòng)子、終止子三部分結(jié)構(gòu)。,注意,②用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵。,③啟動(dòng)子、終止子對(duì)于目的基因表達(dá)必不可少。,④目的基因不能單獨(dú)進(jìn)入受體細(xì)胞，必需以表達(dá)載體的方式攜帶進(jìn)去。,三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,（一）轉(zhuǎn)化：,（二）方法,,將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞,將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞,將目的

20、基因?qū)胛⑸锛?xì)胞,,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,基因槍法,花粉管通道法,——顯微注射法,——感受態(tài)細(xì)胞,目的基因進(jìn)入_________內(nèi)，并且在 受體細(xì)胞內(nèi)維持_____和_____的過(guò)程,受體細(xì)胞,穩(wěn)定,表達(dá),農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,,1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法：（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 ①農(nóng)桿菌特點(diǎn)：,易感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有感染能力,②原理：Ti質(zhì)粒上的T---DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的

21、DNA上。,③過(guò)程：,④優(yōu)點(diǎn),（2）基因槍法（3）花粉管通道法,2、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞①方法：顯微注射法②程序：,目的基因表達(dá)載體提純 取卵（受精卵） 顯微注射 受精卵 新性狀動(dòng)物,,,,常用法：Ca2+處理,常用菌：大腸桿菌,微生物作受體細(xì)胞原因：繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)少,過(guò)程：,Ca2+處理大腸桿菌,,感受

22、態(tài)細(xì)胞,,表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合,,感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA,3.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞,思考：為什么要用Ca2+處理受體細(xì)胞？,用Ca2＋處理，增加細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性,四、目的基因的檢測(cè)與鑒定,——檢查是否成功,四、目的基因的檢測(cè)與鑒定,檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因,1、導(dǎo)入檢測(cè),目的：,方法：,DNA分子雜交技術(shù)(Southern雜交),從轉(zhuǎn)基因生物中提取的基因組DNA,探針？,雜交的對(duì)象？,用放射性同位素標(biāo)記的

23、含目的基因的DNA片段,15N,15N,14N,探針,轉(zhuǎn)基因生物的DNA,變性,變性,,,,,,,14N,,,,過(guò)程,①.首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA②.用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標(biāo)記,以此做探針。③使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明目的基因已插入染色體DNA中,2、轉(zhuǎn)錄檢測(cè),目的：,檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA,方法：,分子雜交技術(shù)（Northern雜交）,用放射性同位素標(biāo)記的含目的基

24、因的DNA片段,探針？,雜交的對(duì)象？,從轉(zhuǎn)基因生物中提取的mRNA.,3、翻譯檢測(cè),目的：,檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì),方法:,抗原-抗體雜交技術(shù),從轉(zhuǎn)基因生物中提取的蛋白質(zhì),抗原？,抗體？,將目的基因編碼的蛋白質(zhì)注射進(jìn)動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行免疫產(chǎn)生的相應(yīng)抗體,4、個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定,抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等,歸納: 基因工程的基本操作程序,獲取目的基因從基因文庫(kù)利用PCR化學(xué)方法人工合成構(gòu)建基因表達(dá)載體目的基因、啟動(dòng)子、終

25、止子、標(biāo)記基因?qū)⒛康幕驅(qū)胧荏w細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法目的基因的檢測(cè)與鑒定檢測(cè)：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯鑒定：,練習(xí)1：(2008理綜山東卷)為擴(kuò)大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開(kāi)發(fā)利用備受關(guān)注。我國(guó)科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。（1）獲得耐鹽基因后，構(gòu)建重組DNA分子所用的限制性內(nèi)切酶作用于圖中的 處，DNA連接酶作用于 處。（填“a”或“b”）,練習(xí)1：(2

26、008理綜山東卷)為擴(kuò)大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開(kāi)發(fā)利用備受關(guān)注。我國(guó)科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。（2）將重組DNA分子導(dǎo)入水稻受體細(xì)胞的常用方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和 法。（3）由導(dǎo)入目的基因的水稻細(xì)胞培養(yǎng)成植株需要利用 技術(shù)，該技術(shù)的核心是 和 。（4）為了確定耐鹽轉(zhuǎn)基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素標(biāo)記的

27、 作探針進(jìn)行分子雜交檢測(cè)，又要用 方法從個(gè)體水平鑒定水稻植株的耐鹽性。,答案：（1）a a （2）基因槍法（花粉管通道法）（3）植物組織培養(yǎng)（1分） 脫分化（去分化） 再分化（4）耐鹽基因（目的基因） 一定濃度鹽水澆灌（移栽到鹽堿地中）,5）基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)施工的。在基因操作的基本步驟中，不進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)的步驟是

28、 （ ） A、人工合成目的基因 B、目的基因與運(yùn)載體結(jié)合 C、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 D、目的基因的檢測(cè)和表達(dá),C,練習(xí),(四)目的基因的檢測(cè)與鑒定,——檢查是否成功,檢測(cè)—,鑒定——,,①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA 上是否插入了目的基因,②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA,③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì),抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等,

29、方法——,方法——,方法——,DNA分子雜交,分子雜交（注意與上不同之處）,抗原抗體雜交,逆轉(zhuǎn)錄法,目的基因的mRNA,目的基因,化學(xué)合成法,肽鏈氨基酸序列,信使RNA序列,基因的核苷酸序列,目的基因,合成,逆轉(zhuǎn)錄,,,2.基因文庫(kù)的構(gòu)建方法,②人工合成法（真核生物）,,,推測(cè),推測(cè),,單鏈DNA,合成,,①基因組文庫(kù)的構(gòu)建,（2）基因文庫(kù)的構(gòu)建方法,通過(guò)對(duì)受體菌的培養(yǎng)而儲(chǔ)存基因,② cDNA文庫(kù)的構(gòu)建-----反轉(zhuǎn)錄法：

30、 以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。,目的基因的mRNA,單鏈DNA,反轉(zhuǎn)錄酶,,,DNA聚合酶,雙鏈DNA(目的基因),（一）從基因文庫(kù)中直接獲取,按照外源DNA片段的來(lái)源：從特定組織提取的染色體基因組DNA ---基因組DNA文庫(kù)（總）mRNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA拷貝----cDNA文庫(kù)（部分）,②基因文庫(kù)的目的,為了在

31、不知目的基因序列的情況下，便于獲得所需的目的基因。,①基因文庫(kù)的分類(lèi),2.基因文庫(kù)的構(gòu)建方法,①：直接分離法,供體細(xì)胞中的DNA,許多DNA片段,運(yùn)載體,限制酶,,,受體細(xì)胞,產(chǎn)生特定性狀,導(dǎo)入,外源DNA擴(kuò)增,,,目的基因,分離,,(鳥(niǎo)槍法),,,多用于原核生物,逆轉(zhuǎn)錄法,目的基因的mRNA,目的基因,化學(xué)合成法,肽鏈氨基酸序列,信使RNA序列,基因的核苷酸序列,目的基因,合成,逆轉(zhuǎn)錄,,,2.基因文庫(kù)的構(gòu)建方法,②人工合成法（真核生