華南師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、1華南師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告學(xué)生姓名學(xué)生姓名林鴻錦學(xué)號20070004002專業(yè)綜合理科二班年級、班級年級、班級07級課程名稱課程名稱生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目醋酸薄膜電泳分離血清蛋白實(shí)驗(yàn)類型實(shí)驗(yàn)類型□驗(yàn)證驗(yàn)證□設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)□綜合綜合試驗(yàn)時(shí)間試驗(yàn)時(shí)間2008年9月8日實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)老師實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)老師陳文利實(shí)驗(yàn)評分實(shí)驗(yàn)評分一、目的一、目的1、掌握醋酸纖維薄膜電泳的原理及操作2、學(xué)會用醋酸纖維薄膜電泳分離血清中各種蛋白質(zhì)組分二、原理二、原理在外電場的作用下，帶

2、電顆粒，例如不處于等電狀態(tài)的蛋白質(zhì)分子，在電場中將向著與其所帶電荷電性相反的電極泳動這種現(xiàn)象稱為電泳。醋酸纖維薄膜電泳是用醋酸纖維薄膜作為支持物的電泳方法。醋酸纖維薄膜由二乙酸纖維素制成，它具有均一泡沫樣的結(jié)構(gòu)，厚度僅120微米，有強(qiáng)滲透性，對分子移動無阻力，作為區(qū)帶電泳的支持物進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳有簡便、快速，樣品用量少，應(yīng)用范圍廣，分離清晰，沒有吸附現(xiàn)象等優(yōu)點(diǎn)。目前已廣泛用于血清蛋白質(zhì)，脂蛋白，血紅蛋白，糖蛋白和同功酶的分離及用于免疫電泳

3、中。蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在pH小于其等電點(diǎn)的溶液中，蛋白質(zhì)為正離子，在電場中向陰極移動；在pH大于其等電點(diǎn)的溶液中，蛋白質(zhì)為負(fù)離子，在電場中向陽極移動。本實(shí)驗(yàn)把血清放在pH8.6緩沖溶液濕透的醋酸纖維膜上進(jìn)行電泳，血清蛋白在pH環(huán)境中以不同速度向正極移動。結(jié)果，血清蛋白在膜條上分為前后幾條平行帶，從負(fù)極端起，依次為γ球蛋白、β球蛋白、α2球蛋白、α1球蛋白和清蛋白。三、材料、試劑與器具三、材料、試劑與器具（一）材料（一）材料1、新鮮血清

4、一無溶血現(xiàn)象（稀釋5倍）。2、醋酸纖維素薄膜——28厘米(浙江黃巖曙光化工廠產(chǎn)品)。（二）試劑（二）試劑1、巴比妥一巴比妥鈉緩沖液（0.07M，pH8.6）：稱取巴比妥1.66克和巴比妥鈉12.76克，溶于少量蒸餾水后定溶到1000毫升。2、染色液：稱取氨基黑10B0.5克，加入蒸餾水40毫升，甲醇50毫升和冰醋酸10毫升，混勻，放于具塞的試劑瓶保存（可重復(fù)使用）。3、漂洗液：取95%乙醇45毫升，冰醋5毫升和蒸餾水50毫升，混勻，在具

5、塞的試劑內(nèi)保存。（三）器具（三）器具1、培養(yǎng)皿（直徑9—10厘米）3（四）染色（四）染色電泳完畢取出膜條，直接浸入染色液中，染色5—10分鐘。然后用漂洗液浸洗，每隔10分鐘換一次漂洗液，直至蛋白區(qū)帶底色脫凈為止，可得色帶清晰的電泳圖譜。以下為實(shí)驗(yàn)得到的血清蛋白電泳圖譜：圖3醋酸纖維薄膜血清蛋白電泳圖譜從左至右，依次為：血清清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白，β球蛋白、γ球蛋白。五、結(jié)果討論五、結(jié)果討論1、實(shí)驗(yàn)效果較好，是因?yàn)樵邳c(diǎn)樣、電泳、染

6、色等環(huán)節(jié)基本能按照實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行，應(yīng)繼續(xù)保持！2、由下表γ球蛋白β球蛋白α2球蛋白α1球蛋白血清清蛋白分子量（D）15萬9—15萬30萬25萬7萬等電點(diǎn)（PI）6.85~7.305.125.565.654.64百分比（%）20.311.537.153.7556.7結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可作出如下分析：（1）由五種蛋白在薄膜上的位置及它們的PI值可知，PI值越小，離負(fù)極越遠(yuǎn)。這是因?yàn)?，它們在同一緩沖液中，PI越小的蛋白分子，會帶上更多的負(fù)電荷，受陽

7、極正電荷吸引力越大，所以跑得越遠(yuǎn)。（2）它們所占百分比的大小決定了區(qū)帶的面積大小和顏色深淺。血清清蛋白所占百分比最大，所以它的區(qū)帶面積最大且顏色最深，γ球蛋白次之，其它也是同樣的道理。3、針對實(shí)驗(yàn)過程中自己及其他同學(xué)出現(xiàn)的這樣那樣的問題，通過自己研究或查找資料的方式，得到以下解決方法：(1)電泳圖譜不齊或分離不良這是電泳分析中最常見的問題，多數(shù)是由于血清滴加不均勻或滴加過多，也有因薄膜質(zhì)量不合要求所致。點(diǎn)樣這一步非常關(guān)鍵，一定要按操作步

8、驟進(jìn)行。首先選擇質(zhì)勻、孔細(xì)、染料吸附少的薄膜充分浸透緩沖液至濕度均勻無干白點(diǎn)。然后將濾紙吸去薄膜表面的多余水份，使薄膜含水量飽和均勻，這樣才能防止薄膜表面液體含量不均，水份移動而引起標(biāo)本移位。點(diǎn)樣前注意關(guān)閉門窗和風(fēng)扇，因空氣流通快可使標(biāo)本和水份蒸發(fā)而影響電泳圖形。點(diǎn)樣要力求做到均勻迅速。(2)電泳圖譜出現(xiàn)條痕問題是由于點(diǎn)樣后薄膜過干，或因電泳槽密閉性不良，或電流過大，溫度升高，薄膜水份蒸發(fā)干燥而造成的。因此薄膜一定要充分浸透后才能點(diǎn)樣，