高中生物教學(xué)里的現(xiàn)代生物技術(shù)及dna復(fù)制

1、www.themegallery.com,1.胞內(nèi)DNA復(fù)制,1.條件 (1)模板 (2)原料—4種dNTPs （dATP ,dGTP,dCTP,dTTP） (3)酶—解旋酶，DNA聚合酶，引物合成酶， DNA連接酶等 (4)能量—高能磷酸鍵水解 （dATP dAMP） (5

2、)引物—RNA,,www.themegallery.com,,,www.themegallery.com,,2.過程：引發(fā)—復(fù)制原點，延伸—dNTP連接至 3’-OH端，終止—整條鏈復(fù)制結(jié)束3.特點：半保留復(fù)制、半不連續(xù)復(fù)制,www.themegallery.com,,4.真核細胞DNA的多起點復(fù)制（每個細胞周期只起始一次）,www.themegallery.com,,例：下圖為真核生物染色體上DNA分子復(fù)制過程示意圖，

3、有關(guān)敘述錯誤的是A．圖中DNA分子復(fù)制是從多個起點同時開始的B．圖中DNA分子復(fù)制是邊解旋邊雙向復(fù)制的C．真核生物DNA分子復(fù)制過程需要解旋酶D．真核生物的這種復(fù)制方式提高了復(fù)制速率,www.themegallery.com,,5.原核細胞的單起點復(fù)制,www.themegallery.com,2.PCR技術(shù),1.條件： 模板 酶—Taq酶 原料—4種dNTPs 能量

4、 引物—兩段與待擴增DNA序列互補的單鏈 DNA，人工合成,www.themegallery.com,,2.過程 高溫變性、低溫退火、室溫延伸,www.themegallery.com,,3.檢測—瓊脂糖凝膠電泳 電泳：帶電荷的供試品（蛋白質(zhì)、核酸等）在惰性支持介質(zhì)（如紙、醋酸纖維素、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等），在電場的作用下，向其對應(yīng)的電極方向按各自的速度進行泳動，使組分分離

5、成狹窄的區(qū)帶，用適宜的檢測方法記錄其電泳區(qū)帶圖譜或計算其百分含量的方法。,www.themegallery.com,,實驗原理：DNA分子在堿性緩沖液中帶負電荷，在外加電場作用下向正極泳動。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。不同DNA的分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時的泳動率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。,www.themegallery.com,,,www.themegallery.com,,制膠,www.theme

6、gallery.com,,電泳、成像,,,www.themegallery.com,,結(jié)果,www.themegallery.com,,例：下圖甲中4號為X病患者，對1、2、3、4進行關(guān)于X病的基因檢測，將各自含有X病基因或正?；虻南嚓P(guān)DNA片段（數(shù)字代表長度）用層析法分離，結(jié)果如下圖乙。下列有關(guān)分析判斷正確的是,www.themegallery.com,3.基因探針,基因探針，即核酸探針，是一段帶有檢測標(biāo)記，且序列已知的，與目的基因

7、或DNA互補的核酸序列(DNA或RNA)。通過分子雜交與目的基因結(jié)合，能從浩翰的基因組中把目的基因顯示出來 。,www.themegallery.com,分子雜交技術(shù)的分類,根據(jù)其檢測對象不同，可分為,www.themegallery.com,基本操作程序,,,,www.themegallery.com,Southern雜交,檢測樣品DNA的處理,,電泳分離及變性處理,,轉(zhuǎn)移并固定到濾膜上,,探針的制備及雜交,,檢測與分析,www.th

8、emegallery.com,樣品DNA的處理,提取檢測樣品的基因組DNA用限制性內(nèi)切酶對其進行酶切，至大小不同的DNA片段,,,www.themegallery.com,電泳分離及變性處理,瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段,變性處理通常DNA變性的方法：熱變性、酸堿變性、化學(xué)試劑變性在0.4M NaOH堿性條件下變性,,,凝膠,,0.4M NaOH,,www.themegallery.com,轉(zhuǎn)移并固定到濾膜上,通過毛細管虹吸法，將

9、凝膠上的DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜或尼龍膜上。最后通過紫外線照射將DNA固定在濾膜上。,www.themegallery.com,探針的制備,一、探針的合成PCR、化學(xué)合成等方法二、探針的標(biāo)記同位素：3H、35S、32P等非同位素：地高辛、生物素、熒光素等,www.themegallery.com,雜交,雜交：在一定的溫度和溶液條件下，將標(biāo)記的探針與濾膜混合，如果濾膜上的DNA分子存在與探針同源的序列，那么探針將與該分子形成雜合

10、雙鏈，從而吸在濾膜上。,洗膜：經(jīng)過一定的洗滌程序?qū)⒂坞x的探針分子除去。,www.themegallery.com,檢測與分析,1、放射自顯影：適用于放射性同位素標(biāo)記的探針2、比色或化學(xué)發(fā)光檢測：適于非同位素標(biāo)記的探針通過放射自顯影或生化檢測，就可判斷濾膜上是否存在與探針同源的DNA分子及其分子量。,,www.themegallery.com,,,www.themegallery.com,4.同位素標(biāo)記和熒光標(biāo)記,www.them

11、egallery.com,同位素標(biāo)記法,同位素：具有相同質(zhì)子數(shù)，不同中子數(shù)的同一元素，互稱同位素，即質(zhì)量不同而化學(xué)性質(zhì)相同的原子。 同位素示蹤法：用示蹤元素標(biāo)記的化合物， 可以根據(jù)這種化合物的放射性，對有關(guān)的一系列化學(xué)反應(yīng)進行追蹤。這種科學(xué)研究方法叫做同位素示蹤法，也叫同位素標(biāo)記法。,www.themegallery.com,,用途：可用于研究細胞內(nèi)的元素或化合物的來源、組成、分布和去向等，進而了解細胞的結(jié)構(gòu)和功能、化學(xué)物質(zhì)的變化

12、、反應(yīng)機理。 還可用于疾病的診斷和治療，如碘的放射性同位素可以用來治療甲狀腺腫大。 一次只能使用一種同位素標(biāo)記,www.themegallery.com,,教材中應(yīng)用到同位素示蹤法的地方 《必修1》經(jīng)典實驗“分泌蛋白的合成和分泌”（ 3H標(biāo)記亮氨酸）?！侗匦?》課外讀“光合作用早期研究簡史”（ 14C標(biāo)記CO2）?！侗匦?》經(jīng)典實驗“噬菌體侵染細菌的實驗”（35S和32P分別標(biāo)記噬菌體外殼和DNA）?！侗匦?》“探究DNA的

13、復(fù)制過程”（15N標(biāo)記NH4Cl）?！哆x修3》DNA分子雜交技術(shù)：用放射性同位素32P標(biāo)記的探針進行目的基因的檢測。,www.themegallery.com,熒光標(biāo)記法,熒光標(biāo)記法（Fluorescent Labeling）：利用熒光蛋白或熒光蛋白基因作為標(biāo)志物對研究對象進行標(biāo)記的分析方法。常用的熒光蛋白為綠色和紅色兩種。優(yōu)勢：可以在同一試驗中，分別或同時使用兩種不同的熒光蛋白分別或同時研究。,www.themegallery.c