動物疫病監(jiān)測診斷基礎(chǔ)理論知識和方法原理

1、動物疫病監(jiān)測（診斷）基礎(chǔ)理論知識和方法原理,臨床癥狀,病理變化,觸片染色鏡檢,,培養(yǎng)特性,生化特性,血清學試驗,初步診斷,動物回歸試驗,,,,確診,,,流行病學調(diào)查,細菌感染的診斷,病毒感染的診斷,病毒的分離,動物接種 是最原始的病毒培養(yǎng)方法，根據(jù)病毒種類不同，選擇敏感動物及適宜接種部位，如嗜 神經(jīng)性病毒（狂犬病毒）可接種于小鼠腦內(nèi)，痘病毒可接種于家兔角膜或皮內(nèi)。,雞胚培養(yǎng) 雞胚對多種病毒敏感。一般采用孵化9-14天的雞

2、胚，根據(jù)病毒種類不同，將病毒標本接種于雞胚的不同部位，最常用的雞胚接種部位有羊膜腔、尿囊腔、絨毛尿囊膜和卵黃囊等。,病毒的分離,,,組織培養(yǎng)法或細胞培養(yǎng)法 是將離體活組織塊或分散的組織細胞加以培養(yǎng)的技術(shù)總稱，為病毒分離鑒定中的最常用的基本方法。,病毒的分離,形態(tài)學檢查,電鏡和免疫電鏡檢查 普通光學顯微鏡檢查 有些病毒在宿主細胞內(nèi)增殖后，在細胞 的一定部位(胞核、胞漿或兩者兼有)出現(xiàn)一個或數(shù)個、圓形或橢圓形、嗜酸性或嗜堿性的

3、結(jié)構(gòu)，即包涵體。包涵體對病毒感染的診斷有一定價值。,病毒感染的血清學診斷,是用已知病毒抗原來檢測病畜血清中有無相應(yīng)抗體，故須待病畜感染后體內(nèi)產(chǎn)生抗體時才能檢出。在采取臨床標本及病人血清應(yīng)注意病程，必須采取患畜急性期血清與恢復期血清 (雙份血清) 進行血清學試驗。若第二次血清抗體滴度比第一次高出4倍以上時，才有診斷意義。,現(xiàn)代免疫的概念：是機體識別“自身”與“非己”抗原，對“非己”抗原產(chǎn)生排斥作用，對自身抗原形成天然耐受的一種生理功能。

4、,免疫的定義,免疫的基本特性,1 識別自身和非自身 這是免疫應(yīng)答的基礎(chǔ)免疫細胞膜表面的抗原受體+外來抗原的表位識別很精細，包括異種之間，同種不同個體之間2 特異性即免疫具有很強的針對性3 免疫記憶對相同抗原物質(zhì)的再次進入具有記憶，會產(chǎn)生更快、更強的免疫應(yīng)答。,免疫的基本功能,1. 抵抗感染指動物機體抵御病原微生物感染和侵襲的能力。免疫功能亢進 變態(tài)反應(yīng)免疫功能低下或缺陷 機會感

5、染2. 自身穩(wěn)定清除機體產(chǎn)生的大量衰老死亡細胞功能異常 自身免疫病3. 免疫監(jiān)視腫瘤細胞的發(fā)現(xiàn)和清除功能低下或失調(diào) 腫瘤發(fā)生,,,,,,免疫的類型,一、固有免疫：概念：出生時即有的天然免疫，經(jīng)遺傳獲得，非特 異性，也稱非特異性/先天性免疫。組成：屏障結(jié)構(gòu)、吞噬細胞、某些體液因子。二、適應(yīng)性免疫：概念：出生后接觸特定抗原獲得的針對該物質(zhì) 的

6、免疫，也稱獲得性/特異性免疫。包括：體液免疫、細胞免疫。,,,,,,抗原,抗原（Antigen，Ag）：是指進入動物機體后，能刺激機體產(chǎn)生特異性免疫球蛋白或致敏淋巴細胞，并能與其發(fā)生特異性反應(yīng)的物質(zhì)，也就是說具有抗原性的物質(zhì)稱抗原。,抗原性包括兩個方面：1.免疫原性：能刺激機體產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細胞的特性。2.反應(yīng)原性：能與由其所誘導產(chǎn)生的抗體或致敏淋巴細胞發(fā)生反應(yīng)的特性。,免疫球蛋白：是指具有抗體活性或化學結(jié)構(gòu)與抗體相似的球蛋白

7、?？贵w：當動物機體受到抗原物質(zhì)刺激后，由B淋巴細胞轉(zhuǎn)化為漿細胞產(chǎn)生的能與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的免疫球蛋白。,抗 體,,,,,,,,,IgG多為單體，占血清免疫球蛋白總量的75%～80%IgG1、IgG2和IgG3的CH2能通過經(jīng)典途徑激活補體IgG是唯一能通過胎盤的抗體通過Fc段與吞噬細胞表面FcR結(jié)合，發(fā)揮調(diào)理作用；與K細胞結(jié)合，發(fā)揮ADCC作用；與葡萄球菌A蛋白結(jié)合。具有抗菌、抗毒和抗病毒作用參與II、III型超敏

8、反應(yīng),IgG,為五聚體，是分子量最大的Ig。IgM激活補體能力比IgG強。IgM是抗原刺激后出現(xiàn)最早的抗體，故檢測IgM水平可用于傳染病的早期診斷。IgM是B細胞抗原受體的主要成分。也可參與II、III型超敏反應(yīng)。,IgM,分為血清型和分泌型兩種，血清型IgA主要由腸系膜淋巴組織中的漿細胞產(chǎn)生。而分泌型IgA(SIgA)是由呼吸道、消化道、泌尿生殖道等處的固有層中漿細胞產(chǎn)生。主要存在于初乳、唾液、淚液，以及呼吸道消化道和泌尿生

9、殖道黏膜表面的分泌液中。分泌型IgA的合成和主要作用部位在黏膜。,IgA,血清IgD含量極低。膜性 IgD存在于成熟B細胞表面，因此，它是成熟B細胞的主要標志。它也是B細胞抗原受體（BCR）。,IgD,血清中含量最低的抗體。能與肥大細胞和嗜堿性粒細胞表面的IgE-Fc受體結(jié)合，介導Ⅰ型超敏反應(yīng)。與抗寄生蟲感染有關(guān)。,IgE,單克隆抗體——由一個B細胞分化增值的子代細胞（漿細胞）產(chǎn)生的針對單一抗原決定簇（表位）的抗體。 多克隆抗

10、體——采用傳統(tǒng)的免疫方法，將抗原物質(zhì)經(jīng)過不同途徑注入動物體內(nèi)，經(jīng)數(shù)次免疫后采血所獲得的抗血清即為多克隆抗體。,人工制備抗體,,,免疫學試驗技術(shù),血清學試驗的類型,血清學反應(yīng)的特點,1. 特異性與交叉反應(yīng)性 2. 可逆性：表面的結(jié)合，有可逆性 3. 適比性：比例合適，反應(yīng)才可見4. 階段性：不可見 可見反應(yīng) 5. 條件依賴性：pH，溫度，電解質(zhì),,抗原抗體結(jié)合除了空間結(jié)構(gòu)互補外，主要以氫鍵、靜電引力、范德華力和疏水鍵

11、等非共價結(jié)合。,表面性與可逆性,Ag和Ab結(jié)合需要適當?shù)谋壤?，Ag或Ab過多過少，都不能形成大的Ag-Ab復合物。,適合比例性,電解質(zhì)：稀釋抗原、血清常用生理鹽水，但稀釋禽類血清時常用8～10%高滲鹽水。酸堿度：稀釋抗原、血清的溶液pH6.0～8.0均可以，為了穩(wěn)定pH，在抗原抗體反應(yīng)中最好用pH7.0～7.2的磷酸緩沖液作抗原抗體稀釋液。溫度：通常為37℃，適當提高反應(yīng)溫度可增加Ag與Ab分子的碰撞機會，加速反應(yīng)的出現(xiàn),影響抗原抗

12、體反應(yīng)的因素,凝集試驗,定義：細菌、紅細胞等顆粒性抗原，或吸附在膠乳、白陶土和紅細胞的抗原，與相立抗體結(jié)合，在有適當電解質(zhì)存在下，經(jīng)過一定時間，形成肉眼可見的凝集團塊，稱為凝集試驗。凝集反應(yīng)中的抗原稱為凝集原，抗體稱為凝集素。分類：凝集試驗可根據(jù)抗原的性質(zhì)、反應(yīng)的方式分為直接凝集試驗 (簡稱凝集試驗)和間接凝集試驗。,一、直接凝集試驗,細菌、螺旋體和紅細胞等顆?？乖?，在適當電解質(zhì)參與下可直接與相應(yīng)抗體結(jié)合出現(xiàn)凝集。直接凝集試驗分為：

13、玻板凝集試驗和試管凝集試驗。,① 玻板凝集試驗,為一種定性試驗方法： 將含有已知抗體的診斷血清 (適當稀釋)與待檢菌懸液各一滴在玻片上混合，數(shù)分鐘后，如出現(xiàn)顆粒狀或絮狀凝集，即為陽性反應(yīng)。此法簡便、快速，常用于菌種鑒定或ABO血型鑒定。 也可用已知的診斷抗原懸液，檢測待檢血清中是否存在相應(yīng)抗體，如布氏桿菌的玻板凝集反應(yīng)和雞白痢全血平板凝集試驗。,②、試管凝集試驗,為一種定量試驗方法： 常用已知抗原液與一系列稀釋

14、的受檢血清混合，保溫后觀察每管內(nèi)抗原凝集程度。以產(chǎn)生50%凝集的最高稀釋度作為血清中抗體的效價（亦稱為凝集價或滴度）。,二、間接凝集試驗,將可溶性抗原 (或抗體)先吸附于一種與免疫無關(guān)的、一定大小的不溶性顆粒 (統(tǒng)稱為載體顆粒)的表面，然后與相應(yīng)抗體 (或抗原)作用，在有電解質(zhì)存在的適宜條件下，所出現(xiàn)的特異性凝集反應(yīng)稱為間接凝集反應(yīng)。,正向間接凝集反應(yīng),用抗原致敏載體以檢測標本中的相應(yīng)抗體,反向間接凝集反應(yīng),用特異性抗體致敏載體以檢測標

15、本中的相應(yīng)抗原。,間接凝集抑制反應(yīng),診斷試劑為抗原致敏的顆粒載體及相應(yīng)的抗體，用于檢測標本中是否存在與致敏抗原相同的抗原。也可用抗體致敏的載體及相應(yīng)的抗原作為診斷試劑，以檢測標本中的抗體，此稱反向間接凝集抑制反應(yīng)。,協(xié)同凝集反應(yīng),與間接凝集反應(yīng)的原理相似，只是所用載體既非天然的紅細胞，也非人工合成的聚合物顆粒，而是一種金黃色葡萄球菌。 ① 它的菌體細胞壁中含有A蛋白(SPA) ② SPA具有與IgG的Fc段結(jié)合的特性因此當

16、這種葡萄球菌與IgG抗體連接時，就成為抗體致敏的顆粒載體；如與相應(yīng)抗原接觸，即出現(xiàn)反向間接凝集反應(yīng)。適用于細菌和病毒等的直接檢測。,基本原理：許多病毒表面具血凝素，具有凝集某些動物或人紅細胞的特性，稱為血凝現(xiàn)象，可用于鑒定病毒。血凝現(xiàn)象可以被特異性抗體所抑制，稱為血凝抑制現(xiàn)象，利用這種特性可進行血清學試驗，稱為血凝抑制試驗。,病毒的血凝與血凝抑制試驗,病毒 + 雞RBC = 凝集（血凝試驗）病毒 + 特異性抗體 +雞RBC = 不凝

17、集（血凝抑制試驗）,,沉淀試驗,定義：可溶性抗原 (如細菌的外毒素、內(nèi)毒素、病毒的可溶性抗原、血清、組織浸出液等)與相應(yīng)抗體結(jié)合，在適量電解質(zhì)存在下，形成肉眼可見的白色沉淀，稱為沉淀試驗 。參與沉淀試驗的抗原稱沉淀原，抗體稱為沉淀素。分類：沉淀反應(yīng)可在液體中進行，也可在半固體瓊脂凝膠中進行。,液相內(nèi)沉淀反應(yīng),絮狀沉淀反應(yīng),環(huán)狀沉淀反應(yīng),凝膠內(nèi)沉淀反應(yīng),瓊擴試驗(Agar gel precipitation test, AGP),①瓊

18、脂凝膠呈多孔結(jié)構(gòu)，孔內(nèi)充滿水分，l%瓊脂凝膠的孔徑約為85nm，因此可允許各種抗原抗體在瓊脂凝膠中自由擴散。 ②Ag和Ab在瓊脂凝膠中相遇，在最適比例處結(jié)合成Ag-Ab復合物，此復合物因顆粒較大而不能擴散，故形成沉淀帶。,中和試驗(病毒、毒素中和試驗),原理：病毒與抗血清中抗體特異結(jié)合后失去感染易感 動物、易感雞胚或鴨胚、易感細胞的活性。用途：①.用已知血清檢測病毒——鑒定病毒，診斷病毒病。②.用已知病毒檢測血清抗體——診

19、斷病毒感染，測定病毒免疫血清效價（中和價）。,補體結(jié)合試驗,1. 定義：有補體參與，以綿羊紅細胞和溶血素作指示系統(tǒng)的抗原抗體反應(yīng)。2. 組成：有2個系統(tǒng)共5種成分 1) 檢測系統(tǒng)：包括已知抗原(或抗體)和待測抗體(或抗原) 2) 指示系統(tǒng)：包括綿羊紅細胞和溶血素(綿羊紅細胞的特異性抗體) 3) 補體：取自豚鼠的新鮮血清3. 補體結(jié)合反應(yīng)的基本原理 1) 補體可與任何抗原抗體復合物相結(jié)合； 2) 指示系統(tǒng)遇補體后就

20、出現(xiàn)明顯的溶血反應(yīng)。,補體結(jié)合反應(yīng),標記免疫技術(shù),免疫酶技術(shù)免疫熒光技術(shù)放射免疫測定免疫膠體金技術(shù)化學發(fā)光免疫測定,二、按標記物分類：,一、按測定用途分類：,,免疫組化技術(shù)：用于組織切片或其他標本中Ag或Ab的定位。免疫測定技術(shù)：用于液體標本中Ag或Ab的測定。,免疫酶技術(shù),將酶分子與Ab或Ag分子連接形成穩(wěn)定的結(jié)合物（酶標抗體或酶標抗原）,不影響：? Ab或Ag的免疫活性? 酶的活性,,原理,常用的酶與底物,,,酶聯(lián)免

21、疫吸附測定,一、基本原理,①、使Ag或Ab吸附到固相載體表面，并保持其免疫活性。②、使Ag或Ab與某種酶連接成酶標Ag或Ab，酶標Ag或Ab既保 留其免疫活性，又保留酶的活性。③、測定時，把受檢標本(測定其中的Ab或Ag)和酶標Ag(或Ab)按不同的步驟與固相載體表面的Ab (或Ag)起反應(yīng)。④、通過洗滌將固相載體上未結(jié)合的Ag或Ab去除，最后結(jié)合在 固相載體上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量

22、成一定的比例。⑤、加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物。,產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)。 可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進行定性或定量分析。,二、ELISA方法的基本類型,●雙抗體（原）夾心法：檢測抗原（體）的常見方法●間接法：檢測抗體的方法●競爭法：檢測抗原或小分子半抗原、抗體,根據(jù)檢測目的和操作步驟不同有三種基本方法,間接ELISA,用于測定抗體。用抗原包被固相載體，然后加入待檢血清樣品，經(jīng)孵育一定時間后，若待檢血清中

23、含有特異性的抗體，即與固相載體表面的抗原結(jié)合形成抗原—抗體復合物。洗滌除去其他成分，再加上酶標記的抗抗體，反應(yīng)后洗滌，加入底物，在酶的催化作用下底物發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生有色物質(zhì)。樣品中含抗體越多，出現(xiàn)顏色越快越深。,雙抗體夾心法,用已知特異性抗體包被固相載體,,,測定管加待測抗原和一定量的酶標抗原使二者與固相抗體競爭結(jié)合,對照管只加一定量酶標抗原與固相抗體直接結(jié)合,,分別洗滌除去未結(jié)合的成分,,加底物顯色,分別測定兩管的吸光度值

24、，根據(jù)對照管與測定管吸光度值之比， 計算標本中待測抗原含量,,競爭法,ELISA問題解析,⑴、實驗室溫度太低；⑵、洗滌液配制不正確或使用了錯誤的洗滌液；⑶、洗滌系統(tǒng)有微生物污染或含有替代洗滌模式；⑷、使用了過度的洗滌次數(shù)；⑸、孵育的時間太短；⑹、試劑或包被板冷；⑺、試劑失效或不同批號的試劑混合；⑻、使用了錯誤的標記物，標記物配制不正確或標記物變質(zhì)；⑼、讀板時波長錯誤，酶標儀功能不正常；⑽、陽性對照被稀釋；⑾、試劑

25、盒使用次數(shù)過多；⑿、試劑盒以前曾使用過。,讀數(shù)偏低可能原因：,常用的免疫膠體金檢測技術(shù),膠體金免疫層析法,將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在NC膜上，膠體金標記試劑(抗體或單克隆抗體)吸附在結(jié)合墊上，當待檢樣本加到試紙條一端的樣本墊上后，通過毛細作用向前移動，溶解結(jié)合墊上的膠體金標記試劑后相互反應(yīng)，再移動至固定的抗原或抗體的區(qū)域時，待檢物與金標試劑的結(jié)合物又與之發(fā)生特異性結(jié)合而被截留，聚集在檢測帶上，可通過肉眼觀察到顯色結(jié)果。該法現(xiàn)已