k第十一章---抗生素類藥物分析

1、第十一章 抗生素類藥物分析 Chapter 11 The Analysis of Antibiotics,,,藥物分析課件系列,INDEX,,,,ContentsFundamental Requirement Section 1 introductionSection 2 β-lactam antibioticsSection 3 Aminoglycosid

2、es antibioticsSection 4 Tetracycline antibioticsSection 5 Quality research of Antibiotics Summary,The structures, properties, identification and assay of β-lactam Antibiotics; β-內(nèi)酰胺抗生素化學結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、鑒別試驗與含量測定；,Content,Th

3、e structures, chemical properties, and assay of aminoglycosides and impurity tests of streptomycin B and gentamycin component C; 氨基糖苷類抗生素結(jié)構(gòu)化學性質(zhì)、鑒別試驗、含量測定及鏈霉素B雜質(zhì)檢查慶大霉素Ｃ組分測定；,The structures, identification, special impu

4、rity tests and assay of tetracyclines; 四環(huán)素類抗生素化學結(jié)構(gòu)性質(zhì)、鑒別試驗、含量測定及鹽酸四環(huán)素中特殊雜質(zhì)檢查;,The quality research review of antibiotics抗生素類藥物質(zhì)量考察研究。.,Fundamental Requirements,掌握本類藥物的化學結(jié)構(gòu)特點理化性質(zhì)，主要鑒別試驗及主要含量測定方法； Mastering the str

5、uctures, physical and chemical properties, primary identification tests and assay methods of antibiotics.,了解典型抗生素有關(guān)雜質(zhì)的分離研究進展。 Understanding the development of relevant substance research for typical drugs.,Sect

6、ion 1 Introduction,Definition 抗生素(antibiotics)是指某些微生物代謝產(chǎn)生的，在很低的濃度即可對某些生物的生命活動有特異抑制或殺滅作用的化學物質(zhì)。 Classification,抗生素,,β-內(nèi)酰胺類 抗生素,四環(huán)素類抗生素,氨基糖苷類抗生素,大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,氯霉素類抗生素,,青霉素及半合成青霉素類頭孢菌素及半合成頭孢菌素類,其他抗生素,青霉素

7、、氨芐西林、阿莫西林、青霉素V頭孢噻吩鈉、頭孢氨芐、頭孢哌酮鈉金霉素、土霉素、四環(huán)素、鹽酸多西環(huán)素、鹽酸美他環(huán)素,鏈霉素、卡那霉素、慶大酶素、新酶素,鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、新霉素,紅霉素、麥迪霉素、螺旋霉素,氯霉素、甲砜霉素,鹽酸林可霉素、磷霉素,,,,,,抗生素在質(zhì)量控制上的特殊性.生產(chǎn)的特殊性 性質(zhì)的特殊性(穩(wěn)定性差)

8、 質(zhì) 量問題 化學純度低, 三多:同系物多(G),異構(gòu)體多(P),降解物多(T),,,,抗生素理化測定法與微生物測定法的關(guān)系. 微生物測定法:用抗生素對微生物的殺傷和抑制程度為指標來衡量抗生素的效價(potency). 原理: 對數(shù)劑量和反應成直線,用管碟瓊脂擴散法. 特點 理化測定法:根

9、據(jù)抗生素的結(jié)構(gòu)特點, 利用其特有的化學或物理化學性質(zhì)及反應而建立的方法. 特點,Section 2 β-Lactam Antibiotics,Structure and Characteristics,β-內(nèi)酰胺類抗生素是指分子中含有四個原子組成的β-內(nèi)酰胺環(huán)的抗生素。β-內(nèi)酰胺環(huán)是該類抗生素發(fā)揮生物活性的必須基團,由四個原子組成的，其分子張力比較大，化學性質(zhì)不穩(wěn)定，易發(fā)生開環(huán)導致失活。,Identification t

10、est,鉀鈉鹽的火焰反應 Flame reaction β-內(nèi)酰胺類藥品中許多為鉀鹽和鈉鹽，可用此反應進行鑒別,呈色反應 Color reaction 羥肟酸鐵反應　　　 堿性環(huán)境中與羥胺作用β-內(nèi)酰胺環(huán)破 裂生成羥肟酸在稀酸中與高鐵離子呈色 . 2. 硫酸硝酸呈色反應　 頭孢菌素類可與之反應呈色，機理多不明 .,茚三酮反應　　

11、　 α-氨基酸的反應,如氨芐西林與斐林試劑反應　 分子中具有(-CONH-)結(jié)構(gòu)，可使堿性酒石酸銅還原顯紫色, 如阿莫西林5. 其他呈色反應: 如重氮苯磺酸呈色反應,,,Orange yellow,沉淀反應Precipitation reaction,1. 在稀鹽酸中生成白色沉淀：青霉素鉀(鈉) 白色游離基沉淀2. 有機胺鹽的特殊反應：

12、 A.重氮化偶合反應： 如普魯卡因青霉素 B.與三硝基苯酚的反應： 如芐星青霉素,加水溶解 加稀鹽酸,,＋,,光譜法Spectroscopy 1.紫外分光光度法(UV) a.最大吸收波長鑒定法 b.水解產(chǎn)物的最大吸收波長鑒定法 2.紅外吸收光譜法(IR) 3.核磁共振光譜(HMR)色譜法Chromatography 1.薄層色譜法(TLC)

13、 2.高效液相色譜法(HPLC),IR spectrum of phenoxymethyl penicillin potassium.Obtained as a KBr disc.,,Assay Iodometric titrationPrinciple：青霉素或頭孢菌素分子不消耗碘，其降解產(chǎn)物消耗碘，例如青霉素族經(jīng)水解后產(chǎn)生青霉噻唑酸可與碘作用，根據(jù)消耗的碘量計算青霉素的含量。Reaction process:N

14、ote： 一般認為碘與青霉素噻唑酸的作用以pH4.5溫度24~26℃為最好； 青霉素的降解產(chǎn)物等雜質(zhì)亦可消耗碘而影響測定結(jié)果，可以用未經(jīng)水解的樣品液作；,,在滴定近終點時放慢滴定速度，并強力振搖；如果滴定至終點時又反現(xiàn)藍色，說明真正的終點尚未到達；由于每摩爾青霉素能吸收較多摩爾的碘（1摩爾青霉素能消耗8摩爾碘），故本法的靈敏度較高。需作標準品對照試驗；嚴格按規(guī)定操作。,本試驗含量計算公式：,含量%=

15、 × × 100%,VTo－VT,,,CS×D,VSo－VS,W,式中：VTo、VSo：滴定供試品空白液和對照品 空白液消耗的硫代硫酸鈉液(0.02mol/L), ml; VT、VS：滴定供試品和對照品消耗的硫代 硫酸鈉液(0.02mol/L),m

16、l; CS：對照品濃度，g/ml； W：供試品取樣量，g； D：供試品稀釋倍數(shù)。,The first step:,,(penicillin 青霉素),青霉噻唑二鈉,第2步反應the second step reaction：,The second step:,+4I2 + 5H2O + 2HCl,＋ NaCl ＋ 8HI,,＋,汞量法 (Mercurimetry)

17、Principle： 青霉素分子不與汞鹽反應，而其堿性水解產(chǎn)物青霉噻唑酸及繼續(xù)水解生成的青霉胺都能與汞鹽定量反應，根據(jù)消耗的汞鹽量可以計算青霉素的含量。 Hg2+ + 2R-SH (RS)2Hg + 2H+ 2. Method (potentiometric titration) Indicator electrode: Pt; reference electrode

18、：Hg-mercurous sulfate electrode； Standard solution：mercuric nitrate solution (0.02mol/L),,3. 討論： a. 本次滴定只有一次突躍。但滴定曲線上出現(xiàn)兩個指示點，即兩次突躍。青霉素含量的計算系以第二次滴定終點為依據(jù)，此時青霉素與巰基汞化物的摩爾比為1︰1。 b. 水解必須完全。溶液的pH值和反應時間直接影響水

19、解的完全程度，水解 如不完全，將使測定結(jié)果偏低。,c. 本法的空白試驗的做法與碘量法類似，空白試驗的目的也是為了消除供試 品中可能存在的降解產(chǎn)物的干擾。 d. 本法與碘量法比較主要優(yōu)點是不需要青霉素標準品作對照，汞鹽滴定液用EDTA標定即可。,酸堿滴定法 (Acid/base titration) Principle： 青霉素或頭孢菌素的β-內(nèi)酰胺環(huán)可被堿水解，此水解系定量完成，可用于含量測定。

20、 如苯唑西林鈉在水溶液中加過量的氫氧化鈉滴滴定液水解后，產(chǎn)生的青霉噻唑酸被中和，再以鹽酸滴定液滴定剩余的氫氧化鈉液，以氫氧化鈉滴定液的消耗量求得苯唑西林鈉的含量。,UV,銅鹽法: 青霉素族抗生素在弱酸性下的降解產(chǎn)物青霉烯酸具有紫外吸收特征。青霉烯酸在320~360nm處有最大吸收,但此水解產(chǎn)物不穩(wěn)定，可加Cu2+，與青霉烯酸形成較穩(wěn)定的螯合物，在320nm處有最大吸收。2.汞鹽法: 青霉素族抗生素在咪唑的催化下與

21、氯化高汞能定量的反應轉(zhuǎn)化呈相應的青霉烯酸硫醇汞鹽，在324~325nm波長范圍內(nèi)有最大吸收。,羥肟酸比色法 青霉素族和頭孢菌素族抗生素能與羥胺作用生成羥肟酸衍生物，在烯酸中與高鐵離子生成紅色絡(luò)合物，在一定波長下測定吸收度而進行定量。,高效液相色譜法HPLC,填充劑：十八烷基硅烷鍵合硅膠流動相：磷酸氫二鈉、枸櫞酸溶液檢測波長：254nm保留時間：7.5min分離度：>4內(nèi)標溶液：乙酰苯胺測定法：內(nèi)標法計算：按內(nèi)標法計

22、算,中國藥典測定頭孢唑林鈉,第三節(jié) 氨基糖甙類抗生素 Section 3 Aminoglycosides antibiotics,本類抗生素的化學結(jié)構(gòu)都是以堿性環(huán)己多元醇為甙元，與氨基縮合而成的甙，故稱為氨基糖甙類抗生素(aminoglycosides antibiotics)。 鏈霉素 (Streptomycin) Structure and properties,streptidine

23、 streptose N-methyl-L-glucosamine,streptobiosamine,,,,Characteristics 鏈霉素的構(gòu)成為一分子鏈霉胍和一分子鏈霉雙糖胺結(jié)合而成的堿性甙。 鏈霉素分子中有三個堿性中心，可與無機酸或有機酸形成可溶于水的鹽，臨床上多用其硫酸鹽。Properties 酸性條件下，鏈霉素水解為

24、鏈霉胍與鏈霉雙糖胺，進一步水解則得到N-甲基-L-葡萄糖胺。弱堿性條件下能使之水解為鏈霉胍及鏈霉雙糖胺，但繼之即將鏈霉糖部分分子重排為麥芽酚(maltol),這一性質(zhì)為鏈霉素所特有，可用于鑒別。,Identification Tests,Ninhydrin reaction Elson-Morgan reaction 鏈霉素經(jīng)水解，產(chǎn)生N-甲基葡萄糖胺，在堿性溶液中與乙酰丙酮縮和成吡咯衍生物，與對二甲氨基苯甲醛的酸性

25、溶液反應即生成紅色縮合物。 Maltol reaction 鏈霉素在堿性溶液中，鏈霉糖經(jīng)分子重排使環(huán)擴大形成六元環(huán)，然后消除N-甲基葡萄糖胺，再消除鏈霉胍生成麥芽酚(α-甲基-β-羥基-γ-吡喃酮)。麥芽酚可與鐵離子在微酸性環(huán)境中形成紫紅色配位化合物。 Sakaguchi reactoin 本品水溶液加氫氧化鈉試液，水解生成鏈霉胍。,,,鏈霉素B雜質(zhì)檢查,BP（1993）規(guī)定了鏈霉素B的檢查項目。甘

26、露糖鏈霉素稱作鏈霉素B，它是鏈霉素分子中N-甲基葡萄糖胺的C4〞位上的羥基連接一個D-甘露糖組成的。,含量測定Assay 目前各國藥典仍采用微生物檢測法。,茚三酮反應Ninhydrin reaction,＋ 2,＋,＋3H2O,,H+,Fe3+,,,,,,,H2O NaOH,Maltol reaction,Maltol,慶大霉素(Gentamycin),Structure and Characteri

27、stics Structure Characteristics 慶大霉素是由絳紅糖胺、脫氧鏈霉胺和加洛糖胺縮和而成的甙。 慶大霉素有五個堿性中心，其堿性相似。能與無機酸或有機酸形成可溶于水的鹽，多用硫酸鹽。Property 硫酸慶大霉素水中易溶，在乙醇、丙酮、氯仿或乙醚中不溶。對光、熱、空氣均較穩(wěn)定，水溶液穩(wěn)定，pH2~12時，100℃加熱30mi

28、n活性無明顯變化。 慶大霉素在紫外無吸收。,,purpurosamine,deoxystreptosamine,garosamine,Structure,鑒別反應Identification,茚三酮反應 Ninhydrin reaction 本品與鏈霉素一樣具有氨基糖甙類結(jié)構(gòu)，羥基胺類和α-氨基酸的性質(zhì)，可與茚三酮生成藍紫色縮和物。Elson-Morgan reaction

29、 與鏈霉素一樣，經(jīng)水解后也產(chǎn)生N-甲基葡萄糖胺(加洛糖胺)在堿性溶液中與乙酰丙酮縮和成吡咯衍生物，與對二甲基苯甲醛的酸性醇溶液反應，生成紅色縮和物。,紫外分光光度法Ultraviolet spectroscopy 慶大霉素分子中無共軛雙鍵系統(tǒng)，故在紫外區(qū)無吸收。薄層色譜法TLC 高效液相色譜法HPLC紅外光譜法IR硫酸鹽反應Sulfate reaction,檢查－慶大霉素C組分測定,慶大霉素C1

30、、C2、C1a對微生物的活性無明顯差異，但其毒副作用和耐藥性有差異，導致各組分的多少影響產(chǎn)品的效價和臨床研究。 中國藥典(2000)、USP(24)和BP(1993)均采用高效液相色譜法，JP(13)采用薄層色譜法和薄層微生物顯像法測定各組分的含量。,含量測定Assay 目前各國藥典仍用微生物檢定法。,第四節(jié) 四環(huán)素類抗生素 Section 4 Tetracyclines,本類抗生素在化學結(jié)

31、構(gòu)上，都具有氫化四駢苯環(huán)，故統(tǒng)稱為四環(huán)素族或四環(huán)素類(tetrac- yclines)抗生素。,化學結(jié)構(gòu)與性質(zhì) 結(jié)構(gòu)Structure 性質(zhì)Character,Structure,兩性化合物Amphoteric compound；其鹽酸鹽易溶于水，并溶于堿或酸性溶液中；結(jié)晶性物質(zhì)，在水中結(jié)晶者，均含有結(jié)晶水； 旋光性O(shè)ptical rotation；

32、差向異構(gòu)化性質(zhì)Epimerization —— 差向四環(huán)素；酸性降解 Acid degradation—— 脫水四環(huán)素；堿性降解 Base degradation—— 異四環(huán)素； 中性降解 Neutral degradation—— 紫紅色縮和物； 與金屬離子形成配位化合物。,鑒別試驗Identification,,i.濃硫酸反應Con. Sulfuric acid ii.三氯化鐵反應Ferric chloride re

33、action,氯化物反應Chloride reaction 本類抗生素多用鹽酸鹽，可與硝酸銀在酸性條件下生成氯化銀白色沉淀。iv.紫外分光光度法UV 本類抗生素分子內(nèi)含有共軛雙鍵系統(tǒng)，在紫外光區(qū)有吸收。熒光法Fluorescence 本類抗生素分子內(nèi)含有共軛雙鍵系統(tǒng)，在紫外光照射下能產(chǎn)生熒光，它們的降解產(chǎn)物也具有熒光。vi.薄層色譜法TLC 四環(huán)素類抗生素的薄層色譜多采用硅藻土作載體，為獲得較好得分離，在粘合

34、劑中加有聚二乙醇400、,甘油以及中性的EDTA緩沖液。EDTA可以克服因痕量的金屬離子存在而引起的脫尾現(xiàn)象。本類抗生素及其降解產(chǎn)物在紫外光(365nm)下產(chǎn)生熒光的性質(zhì)，可用與檢出斑點并以標準品對照進行鑒別。其他方法Other method 紅外光譜法及高效液相色譜法,鹽酸四環(huán)素中特殊雜質(zhì)檢查( Impurity test in tetracycline)含量測定Assay 比色法Colorimetric metho

35、d 高效液相色譜法 HPLC,第五節(jié)    抗生素類藥物的質(zhì)量考察研究 Section 5 Quality Research Review of Antibiotics,青霉素中致敏雜質(zhì)的分離制備 凝膠過濾法Gelfiltrationmethod GDX104柱色譜GDX104column chromatography雜質(zhì)的研究Researc

36、h of impurity 光譜法Spectroscopy Penamaldate法測定青霉噻唑基團――青霉素過敏反應主要抗原決定簇 紫外光譜分析UV 紅外光譜分析IR,色譜法Chromatography 薄層色譜法TLC 高效液相色譜法HPLC 氣相色譜法GC 凝膠過濾色譜法 Gelfiltrationmeth