儀器分析第11章色譜分析導(dǎo)論

1、§11—1 色譜法及其分類,★色譜法是一種分離技術(shù)， 是混合物最有效的分離、 分析方法。俄國植物學(xué)家茨維特在1906年使用的裝置——色譜原型裝置，如右圖所示。,茨維特實驗,一、色譜：,色譜法又叫色層法、層析法，以試樣組分在固定相和流動相間的溶解、吸附、分配、離子交換或其他親和作用的差異為依據(jù)而建立起來的各種分離分析方法。,色譜柱：進(jìn)行色譜分離用的細(xì)長管。固定相：管內(nèi)保持固定、起分離作用的填充物。流動相：流經(jīng)固定

2、相的空隙或表面的沖洗劑。,色譜法分離實質(zhì)：當(dāng)流動相中攜帶的混合物 流經(jīng)固定相時，其與固定相發(fā)生相 互作用。由于混合物中各組分在性 質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異，與固定相之間 產(chǎn)生的作用力的大小、強(qiáng)弱不同， 隨著流動相的移動，混合物在兩相 間經(jīng)過反復(fù)多次的分配平衡，使得 各組分被固定相保留的時間不同， 從而按一定次序由固定相

3、中流出。,兩相及兩相的相對運動構(gòu)成了色譜法的基礎(chǔ),二、色譜的分類：,1.按流動相和固定相的物理狀態(tài)分類：,,,氣相色譜（流→氣）,液相色譜（流→液）,2.按產(chǎn)生分離過程的相系統(tǒng)的形式分類：,用玻璃柱子做色譜柱，固定相填裝在柱子中,用毛細(xì)管做色譜柱，固定相填裝在管壁,用平整的板子作固定相支持的載體，固定相平鋪在板上,,,,3.按分離過程原理分類：,吸附,萃取,靜電作用和擴(kuò)散,擴(kuò)散,生物特性,,,,,,4.按展開程序分類：,組分與固定相

4、作用力＞ 流動相與固定相作用力,組分與固定相作用力＜ 流動相或其他物質(zhì)與固定相作用力,,,三、色譜分離過程：,色譜分離過程是在色譜柱內(nèi)完成的,§11—2 色譜流出曲線和術(shù)語,一、線性洗脫色譜：,1.分配等溫線與分配系數(shù)K：,●分配等溫線：在一定溫度 下，溶質(zhì)在固定相與流動 相之間的分配曲線，此曲 線稱為分配等溫線。,●分配系數(shù)K ：分配等溫線 的斜率。,,① 若K與濃度無關(guān)，則分

5、配等溫線為直線；,② 在色譜過程中，圖中 的C、D型很少出現(xiàn)； A、B型常見，但不能 用于測定；,③ 在溶質(zhì)濃度低時，Cs 基本上正比于Cm，曲 線近似直線。,,2.線性洗脫色譜：,●在色譜中，分配系數(shù)K為常數(shù)時所進(jìn)行的色譜 過程，即稱為,線性洗脫色譜。,結(jié)論：,CS值大，則K值大，溶質(zhì)進(jìn)入固定相的量就多。,推論：,溶質(zhì)流過色譜柱時，分配系數(shù)K值大的組分通過色譜柱所需時間長，而K值小的組分通過色譜柱所需

6、時間短。當(dāng)樣品中各組分在兩相的分配系數(shù)K不同時，就能實現(xiàn)差速遷移，達(dá)到分離的目的。,二、相關(guān)術(shù)語：,色譜圖：,色譜柱流出物通過檢測器時所產(chǎn)生的響應(yīng)信號對時間的曲線圖。縱坐標(biāo)為信號強(qiáng)度，橫坐標(biāo)為保留值。,,,保留值：,（熱力學(xué)因素）——即組分在色譜柱中固 定相上停留的時間。,① 式中各項單位可用 min、s、cm等表示；,③ 保留時間是色譜定性的基本依據(jù)，但同 一組分的保留時間受流動相流速的影響，

7、 因此，色譜定性分析常采用保留體積等 定性。,,② 實際上是組分在固定相中停留的總時間；,死體積VM：,指色譜柱在填充后，柱管內(nèi)固定相顆粒之間的空間、色譜儀器管路的空間及檢測器的空間的總和?；蛘哒f，在死時間內(nèi)通過色譜柱的流動相體積。 VM=tM×F0（流動相流速，L/min）,保留體積VR：,在保留時間內(nèi)通過色譜柱的流動相體積。即將組分從柱中帶出所需的流動相體積。 VR=tR×F

8、0,相對保留值 r21：,某組分2與組分1的調(diào)整保留值之比。,某組分的保留體積扣除死體積后的剩余體積，稱為該組分的調(diào)整保留體積。 =VR-VM,調(diào)整保留體積 ：,① r21只與色譜柱溫度和固定相的性質(zhì)有關(guān)，與色 譜柱的柱長、柱徑、填充情況以及流動相流速 無關(guān)，因此，它是一個廣泛使用的定性數(shù)據(jù)；,② r21絕對不是兩組分的 VR或tR之比；,③ 在多元混合物分析時，通常選擇一對最難分離 的物質(zhì)對，將

9、它們的相對保留值作為重要參 數(shù)。在這種情況下，r21可用α表示：,,,為后出峰的組分的調(diào)整保留時間，故α總是大于1的。,分配比k：,也稱容量因子。它是指組分在固定相和流動相中的分配量之比。,,,,,,,區(qū)域?qū)挾龋海▌恿W(xué)因素）,標(biāo)準(zhǔn)偏差σ：0.607倍峰高處色譜峰寬的一半。,,,,§11—3 色譜分析基本原理,一、色譜法中組分分離條件,A、B兩組分沿色譜柱移動時，不同位置處的濃度輪廓,① 兩組分的分配系數(shù)必須有 差

10、異；,② 區(qū)域擴(kuò)寬的速率應(yīng)該小于 區(qū)域分離的速率；,③ 在保證快速分離的前提下，提 供足夠長的色譜柱。,二、色譜法基本理論, 塔板理論,1.理論假設(shè),將色譜柱視為精餾塔，即色譜柱是一系列連續(xù)的、相等的水平塔板組成，每一塊塔板的高度用H表示，稱為塔板高度，簡稱板高。,② 流動相進(jìn)入色譜柱不是連續(xù)進(jìn)行的，而是 脈動式，每次進(jìn)氣為一個塔板體積(ΔVm)；,③ 所有組分開始時存在于第0號塔板上，而且 試樣沿軸（縱）向擴(kuò)散

11、可忽略；,④ 分配系數(shù)在所有塔板上是常數(shù)，與組分在某 一塔板上的量無關(guān)。,塔板理論假設(shè)：,① 在柱內(nèi)一小段長度H內(nèi)，組分可以在兩相間 迅速達(dá)到平衡。這一小段柱長稱為理論塔板 高度H；,2.理論塔板數(shù)（溶質(zhì)平衡次數(shù)）,根據(jù)塔板理論假設(shè)，在每一塊塔板上，溶質(zhì)在兩相間很快達(dá)到分配平衡，然后隨著流動相按一個一個塔板的方式向前移動。對于一根長為L的色譜柱，溶質(zhì)平衡的次數(shù)應(yīng)為：,理論塔板數(shù),,色譜柱的柱效隨理論塔板數(shù)n的增加而增加

12、， 隨板高H的增大而減小。,色譜柱分離混合組分的能力,3．塔板理論對色譜的解釋：,第一，當(dāng)溶質(zhì)在柱中的平衡次數(shù)，即理論塔板數(shù)n 大于50時，可得到基本對稱的峰形曲線；,第二，當(dāng)樣品進(jìn)入色譜柱后，只要各組分在兩相 間的分配系數(shù)有微小差異，經(jīng)過反復(fù)多次 的分配平衡后，仍可獲得良好的分離；,第三，n與半峰寬及峰底寬的關(guān)系式為：,,,即在tR一定時，若色譜峰越窄，則n值越大

13、，H越小，柱效能越高。,,4.有效塔板數(shù),注意：同一色譜柱對不同物質(zhì)的柱效能是不 同的。當(dāng)選用這些指標(biāo)表示柱效時， 應(yīng)指明對何種物質(zhì)而言。,,5.塔板理論的特點,① 定量說明了溶質(zhì)在色譜柱中移動的速率；,●成功點：,② 解釋了流出曲線的形狀；,③ 提出了計算和評價柱效能高低的參數(shù)。,●不足點：,① 定性地給出板高的概念，卻不能找出影 響板高的因素；,② 不能說明為什么在不同的流速下，可以 測得不同的理

14、論塔板數(shù)。, 速率理論：,速率理論指出：在色譜分離過程中，譜峰的擴(kuò) 寬受渦流擴(kuò)散、分子擴(kuò)散和傳 質(zhì)阻力三個動力學(xué)因素的控制。,板高方程為：,A、B、C —— 常數(shù)。A為渦流擴(kuò)散項系數(shù) B為分子擴(kuò)散項系數(shù) C為傳質(zhì)阻力項系數(shù),,—— 流動相的平均線速度；,,一定時，只有當(dāng)A、B、C較小時，板高H才能小，柱效才

15、會高；反之，則柱效低，色譜峰擴(kuò)張。,1.渦流擴(kuò)散項（A）,變寬的程度由下式?jīng)Q定：,A=2λdp,① A與填充物的平均直徑dp和填充不規(guī)則因 子λ有關(guān)，與流動相的性質(zhì)、線速度和 組分性質(zhì)無關(guān)；,② 使用顆粒細(xì)和均勻的填料，采用均勻填 充，是減小渦流擴(kuò)散和提高柱效的有效 途徑。,,2.分子擴(kuò)散項（ ）,氣體分子的分子擴(kuò)散項系數(shù)B為：,B=2γDg,γ—— 彎曲因子。它表示柱填充物對分子擴(kuò)散 的阻礙程度

16、。,Dg—— 組分在氣相中的擴(kuò)散系數(shù)（cm2.s-1）。 Dg除與組分性質(zhì)有關(guān)外，還與組分在氣 相中的保留時間、柱溫、柱壓和載氣的 性質(zhì)等因素有關(guān)。,為減小分子擴(kuò)散引起的色譜峰變寬，可采用：,① 用較高的載氣流速；,② 使用相對分子量較大的載氣；,③ 控制較低的柱溫。,3.傳質(zhì)阻力項（Cū）,物質(zhì)系統(tǒng)由于濃度不均勻而發(fā)生的物質(zhì)遷移（從一相轉(zhuǎn)入另一相）過程。,影響傳質(zhì)過程進(jìn)行速度的阻力。,傳質(zhì)：,

17、傳質(zhì)阻力：,① 氣相傳質(zhì)阻力系數(shù) Cg,Cg——描述影響組分從氣相轉(zhuǎn)移到固定相表 面這一過程的傳質(zhì)速度的因素。,,造成譜峰擴(kuò)寬,對于填充柱 ：,采用粒度小的填充物和相對分子量小的載氣，可減小Cg值，提高柱效。,② 液相傳質(zhì)阻力系數(shù)Cl,Cl——描述影響組分在液相中傳質(zhì)速度的 因素 。,a.降低固定液含量，df減小，但容量因子k也 隨之變小，對分離不利；,b.固定液含量一定時，df值隨載體的比表面積 增加而

18、降低。因此，一般用比表面積較大的 載體來降低df值；,c.提高柱溫，Dl增大，但k值減小，故應(yīng)控制 適當(dāng)?shù)闹鶞亍?減小固定液的液膜厚度df，增大組分在液相中的擴(kuò)散系數(shù)Dl，可以減小 Cl值。,4.范氏方程式（速率理論方程式： ）,選擇色譜分離條件具有重要的指導(dǎo)意義。它可以說明固定相的填充均勻程度、粒度、液膜厚度、載氣種類和流速等因素的變化對柱效和色譜峰展寬的影響。,,,§11—4 分離度,一、分離度Rs：,定義：,相

19、鄰兩組分色譜峰保留值之差與該兩組分色譜峰基線寬度平均值之比。,定義式：,① 當(dāng)Rs＜1時，兩色譜峰總是有部分重疊；,② 當(dāng)Rs=1.0時，兩色譜峰的分離程度可達(dá) 98%；,③ 當(dāng)Rs=1.5時，兩色譜峰的分離程度達(dá) 99.7%。,④ 當(dāng)Rs值更大時，分離效果更好，但會延長 分析時間，使色譜峰變寬，對分析反而不 利。,Rs=1.5為相鄰兩色譜峰完全分離的標(biāo)志,二、影響Rs的因素：,,② 容量因子k值增大，分離度增大

20、，分析時間 延長，甚至造成譜帶檢測困難。通?？刂?容量因子k=2～7；,③ 相對保留值α有微小增大，都會使Rs值有 較大增加。當(dāng)α=1時，Rs=0,不能分離。,,例：用3米長的填充柱進(jìn)行色譜分離，得到如 下圖所示的分離。為了使二者剛好能夠分 離完全，柱子長度最短需多少？,分析：,分離完全？,,Rs＝1.5,,,最短柱長？,,,,,,分離條件不變，H、k2、α為常數(shù),,解：,∵,∴,由題可知，分離條件未變

21、，故板高H、相對保留值α、容量因子k等不變，它們是常數(shù)，則有：,對于3米長的色譜柱，由題給的條件可計算出它的分離度Rs值。,由圖可知：,,,∵,∴,若要完全分離，則要求Rs＝1.5，設(shè)此時需要柱長為Lx，則有：,,,,解之得：,答：（略）,§11—5 色譜定性分析和定量分析,一、定性分析：,●色譜定性分析的任務(wù)：,比較已知物質(zhì)與未知物質(zhì)在相同條件下的保留參數(shù)或在固定相上的位置，即可確定物質(zhì)物質(zhì)是何種物質(zhì)。,確定色譜圖上每一個

22、色譜峰所代表的是什么物質(zhì)。,●方法：,二、定量分析,色譜定量分析的理論依據(jù)：,在一定色譜條件下，組分的質(zhì)量或其在流動相中的濃度，與檢測器的響應(yīng)值成正比。,色譜峰面積,色譜峰峰高, 峰高和峰面積的測定,峰高——從色譜圖上直接測量。,峰面積——計算的辦法求得：, 定量校正因子,1.絕對校正因子,絕對校正因子表示單位峰面積或單位峰高所代表的物質(zhì)質(zhì)量：,2.相對校正因子fis,① 相對校正因子：,是指某組分i與基準(zhǔn)物質(zhì)S的絕對校正因子之比。,質(zhì)

23、量校正因子：,② 相對校正因子的測定,準(zhǔn)確稱取被測組分和標(biāo)準(zhǔn)組分的量，然后在實驗條件下進(jìn)行分析，測量各色譜峰的面積或峰高，代入fis表達(dá)式計算。, 定量方法,1.外標(biāo)法——標(biāo)準(zhǔn)曲線法：,將待測組分的純物質(zhì)配成不同含量的標(biāo)液，定量進(jìn)樣，然后以色譜圖上對應(yīng)的峰面積或峰高對百分含量作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，在相同條件下，注入同體積的試樣分析，用內(nèi)插法定量。,2.歸一化法：,若試樣中有n各組分，則組分i的百分含量為：,3.內(nèi)標(biāo)法：,在一定量的試樣中，加