各類層析色譜分析技術完全講解

1、層析技術,第一節(jié) 層析概述,,層析法也稱色譜法(chromatography)，是1906年俄國植物學家Michael Tswett發(fā)現(xiàn)并命名的。他將植物葉子的色素通過裝填有吸附劑的柱子，各種色素以不同的速率流動后形成不同的色帶而被分開，由此得名為“色譜法”。后來無色物質也可利用吸附柱層析分離。,一、概況,1941年，英國生物學家Martin和Synge首先提出了色譜塔板理論，為后來各種色譜技術的發(fā)展奠定了基礎。 194

2、4年出現(xiàn)紙層析。以后層析法不斷發(fā)展，相繼出現(xiàn)氣相層析、高壓液相層析、薄層層析、親和層析、凝膠層析等。 層析法是利用混合物中各組分物理化學性質的差異（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等），使各組分在兩相（一相為固定的，稱為固定相；另一相流過固定相，稱為流動相）中的分布程度不同，從而使各組分以不同的速度移動而達到分離的目的。 層析技術是一種分離技術，是混合物最有效的分離、分析方法。,經典色譜（offl

3、ine),Tswett把植物綠葉的色素混合液加在一根裝有干燥固體碳酸鈣顆粒（稱固定相）的玻璃長管（稱為填充色譜柱）上端;洗脫劑（亦稱流動相）石油醚自上而下流過；在石油醚不斷沖洗下，原來在柱子上端的色素混合液向下移動。由于色素中各組分的性質的差異，最后分離成不同顏色的清晰色帶；將潮濕的碳酸鈣擠出玻璃管，用刀將各色帶切下，對其中的組分用合適的分析方法分別進行測定。,現(xiàn)代色譜（online),,當一個二組分（A和B）的混合樣品在t1時間

4、從柱頭加入;隨著流動相不斷加入，洗脫作用連續(xù)進行，直至A和B組分先后流出柱子而進入檢測器;從而使各組分濃度轉變成電信號后記錄在記錄紙上，或顯示在熒光屏上，或由電腦貯存后打印出來。,層析技術的原理,層析系統(tǒng)都由兩個相組成：一是固定相(不動的一相)，它或者是固體物質或者是固定于固體物質上的成分；另一是流動相(攜帶樣品流過固定相的流動體)，即可以流動的物質，當待分離的混合物通過固定相時，由于各組份的理化性質存在差異，與兩相發(fā)生相互作用（吸

5、附、溶解、結合等）的能力不同，在兩相中的分配（含量對比）不同，與固定相相互作用力越弱的組份，隨流動相移動時受到的阻滯作用小，向前移動的速度快。反之，與固定相相互作用越強的組份，向前移動速度越慢。分部收集流出液，可得到樣品中所含的各單一組份，從而達到將各組份分離的目的。,,二、層析法的特點,分離效率高：復雜混合物、有機同系物、異構體、手性異構體。靈敏度高：可以檢測出μg.g-1(10-6)級甚至ng.g-1(10-9)級的物質量。分析

6、速度快：一般在幾分鐘或幾十分鐘內可以完成一個試樣的分析。應用范圍廣不足之處：被分離組分的定性較為困難。,層析應用范圍,凡是溶于水和有機溶劑的分子和離子，在性質上有一定差異均可通過層析方法進行分離。分離的范圍包括：無機化合物：無機鹽類、無機酸類、絡合物類等有機化合物：烷烴類、有機酸和有機胺類、雜環(huán)類生物大分子：核酸和核苷酸類、蛋白質、酶及肽類、多糖及寡糖類、激素類活體生物： 病毒、細菌、細胞器等,分析的參數(shù),

7、常見的層析分離法分析技術，是以混合物中分離單一成分，制備一定量的產品為主，以分析鑒定化合物的性質，獲得分析參數(shù)為輔。HPLC以分析為主。通過層析方法可以對物質進行一定程度的定量、定性和純度鑒定。,按層析原理分類（一）,,按層析原理分類（二）,離子交換層析：利用不同組分對離子交換劑親和力的不同。,吸附層析：利用吸附劑表面對不同組分吸附性能的差異，達到分離鑒定的目的。,凝膠層析：利用某些凝膠對于不同分子大小的組分阻滯作用的不同。,按層析

8、過程的機理分類,按兩相所處狀態(tài)分類,超臨界分析：利用流動相溶劑分子的氣態(tài)和液態(tài)臨界點的條件下進行分離，更具專一性。,按操作形式不同分類,層析分類法,紙上層析是用濾紙作為支持劑（載體）的一種色層分析法，這種方法的基本原理一般認為主要是利用混和物中各組分在流動相和固定相間的分配比的不同而使之分離。 紙上層析可用于化學性質相近的混和物的分離，特別適宜于微量物質的分離和鑒別。而且使用的儀器簡單，操作比較容易，重現(xiàn)性好。,三、層析前蛋白質處

9、理,主要是利用鹽析法、等電點沉淀、有機溶劑沉淀等方法，使目的蛋白與其它較大量的雜蛋白分開，這些方法的特點是簡便、處理量大、既能除去大量雜質，又能濃縮蛋白質，但分辨率低。,1、鹽析法,鹽離子與水分子作用，原來溶液中大部分的自由水轉變?yōu)辂}離子的水化水，從而降低蛋白質極性基團與水分子之間的作用，破壞蛋白質分子表面的水化層，暴露出來的蛋白質表面疏水性區(qū)域相互結合，形成沉淀。,2、等電點沉淀,在溶液pH值等于蛋白質等電點時，蛋白質的溶解度最小，容

10、易互相吸引，聚合成沉淀；加入鹽離子會破壞這些吸引力，使分子散開，溶入水中。,3、有機溶劑沉淀,降低水溶液的介電常數(shù)，增加蛋白質不同電荷之間的靜電引力，使蛋白質產生沉淀； 有機溶劑與水作用使蛋白質的表面水化層厚度壓縮，導致蛋白質脫水，蛋白質間的疏水作用增強，從而產生沉淀。,四、層析基本操作過程,,上樣均一性 洗脫裝置,目的不同 檢測方法不同活性檢測,基質均勻性柱層析的L/d比值,1、柱層析的L/d比值,,2、洗脫裝置

11、,不改變溶劑體系 依靠液面的水位差產生的靜壓力致使洗脫液不斷流經層析柱缺點：隨著溶液的流去，水位差也逐漸減小，流速也在變小。改善：蠕動泵或恒流泵,維持流速恒定的簡易裝置,,改變溶劑系統(tǒng),分級洗脫 在一個溶劑系統(tǒng)洗滌后，改用另一溶劑系統(tǒng)。缺點：蛋白質和層析基質的結合強度相差并不很大，溶劑系統(tǒng)的改變又不可能過細過密，同一個洗脫級組分中就可能含有兩種或兩種以上的蛋白質，達不到分離純化的目的。,,改變溶劑系統(tǒng),梯度洗脫

12、 一種溶液以恒定的速度連續(xù)地進入處于溫和攪拌的盛有另一種溶液的容器中，經混合后的液體以同速度沉入層析柱作為洗脫液，在這樣所得到的洗脫液中一種溶液的濃度以線性梯度方式連續(xù)地發(fā)生改變。注意：梯度洗脫呈現(xiàn)一個峰，但有可能存在兩個性質接近的蛋白質。,線性梯度洗脫裝置,性能未知樣品的蛋白質分離： 改變緩慢的梯度洗脫→若為單峰：分級洗脫,3、結果檢測,活性檢測 比活沒有提高 目的蛋白與雜蛋白并沒有分開

13、比活有所提高，但總活性回收很低 目的蛋白有損失或有失活現(xiàn)象測定蛋白質一級結構時，可不考慮目的蛋白的生物活性,結果保存薄層層析&紙層析 照相保存or 掃描儀轉為圖形or 積分儀變成數(shù)據柱層析 檢測器、記錄儀和積分儀處理,4、層析裝置的儀器化,HPLC,與電腦、質譜等連用,伯樂公司duoflow中高壓層析儀,安馬西亞公司akta高效快速層析儀,液相層析技術,

14、概況,分離范圍：無機化合物有機化合物生物大分子活體生物應用范圍：大規(guī)模生產小型制備、微量分離定性定量分析,液相層析儀,伯樂公司duoflow中高壓層析儀,安馬西亞公司AKTA高效快速層析儀,組份收集器,,操作控制,,動力系統(tǒng),,工作臺,,層析柱管,填充技術,介質的預處理：溶脹、漂洗、再生、轉型、脫氣等濕法填充：攪拌懸浮，自然沉降。填充質量,檢測器,紫外檢測器熒光檢測器折光檢測器電導檢測器,固定相,固定相是不溶

15、于溶劑和水的固定化顆粒，又稱為層析介質、層析填料、填充劑等。包括：無機材料：硅膠，氧化鋁有機材料：聚苯乙烯等多糖類材料：葡聚糖、瓊脂糖、聚丙烯酰胺,層析介質與生物大分子的關系,大孔徑的，親水性好的球形材料。多糖類凝膠層析介質最常用SephadexSepharoseBio-Gel缺點：剛性差，不耐壓，分離時間長,層析介質的性能,層析介質的形狀：球形，不定形技術指標粒度大小：粒度小，分離效果好，但流速慢均勻度：均勻

16、，流速快，峰值集中機械強度：強度高，流速快，保留值小，柱效高理化性質：穩(wěn)定，非特異性吸附少，親水性好，耐酸堿和有機溶劑吸附容量：單位質量或體積的層析介質吸附流動相中溶質的質量。,流動相,流動相緩沖溶液：根據待分離物質的性質（等電點、極性、溶解度、穩(wěn)定性等）選擇緩沖溶液及其濃度、pH值、離子強度、緩沖容量等。保護劑：抗氧化劑、穩(wěn)定劑、蛋白酶抑制劑等有機溶劑：根據待檢測物質的極性及溶解度來選擇不同極性的溶劑。,第一節(jié) 吸附層析

17、,吸附層析,定義：利用吸附劑對不同物質的吸附力不同而使混合物中的各組分分離的方法。原理：層析介質表面的吸附基團對溶質發(fā)生吸附作用，該基團對不同溶質的吸附能力的強弱有較大的差異，可根據這種差異性，將不同溶質進行分離。,原理,根據物料中各組分對固定相(吸附劑) 的吸附程度不同，以及其在相應的流動相(溶劑)中溶解度的差異來實現(xiàn)。經反復的吸附—解吸—再吸附—再解吸的過程，達到分離目的。無化學鍵引入，只存在相對較弱的氫鍵力、范德華力和偶極力

18、相互作用。吸附力的產生,吸 附,吸附：任何兩相都可以形成界面，其中一相的物質或溶解在其中的溶質在另一相表面上發(fā)生密集行為。吸附現(xiàn)象：溶質從溶液中到停留在固體表面上的現(xiàn)象，固-氣、固-液、氣-液。吸附介質：凡是能夠將周圍其他分子聚集到某一物質表面上的材料。被吸附物質：能夠聚集在吸附介質表面的分子。,吸附種類,物理吸附：是依靠分子間相互作用的范德華力引起的吸附，非特異性吸附，吸附速度快，吸附力較強。化學吸附：是依靠物質

19、中的化學鍵的作用引起吸附，是選擇性吸附，吸附速度慢，吸附力強，不易解吸。復合吸附：是指物理和化學吸附同時發(fā)生。飽和吸附：在單位時間內被吸附物在吸附介質某一表面積上的分子與同一單位時間內的該介質的同一表面上解吸附的分子達到了動態(tài)平衡，處于該環(huán)境中吸附介質的吸附作用達到飽和。,吸附劑的選擇,性能：表面積大、顆粒均勻、吸附選擇性好、穩(wěn)定性強、成本低廉極性：羥基磷灰石，硅膠，氧化鋁，人造沸石非極性：活性炭,吸附劑,活性炭硅膠氧化鋁

20、聚酰胺羥基磷灰石,吸附介質的分類及其性質（一）,羥基磷灰石特點：抗機械強度弱。原理：溶質分子中的酸性基團與洗脫液中的磷酸根離子對羥基磷灰石中的鈣離子有競爭作用。應用：分離有序和無序的生物大分子，如分離RNA和DNA等。,吸附介質的分類及其性質（二）,硅膠：化學性質穩(wěn)定、吸附量大。原理：顆粒表面存在的很多硅酰基作為活性中心與所進行層析的化合物形成強的氫鍵作用。硅酰基能夠通過氫鍵的形成而吸附水分，并隨著吸著的水分增加而降低吸附

21、力。制備：一種多孔性物質,因-O-Si(-O-)-O-Si(-O-)-O-結合而具有三維結構,表面具有硅羥基,作吸附劑的硅膠需經加熱處理,除掉其表面吸附水,使之活化。按其孔徑分布分為表面多孔和全多孔兩類。硅膠既是吸附色譜最常用的固定相，也是分配色譜、離子色譜等色譜固定相的常用基質。,硅 膠,影響表面積的因素：酸化時的pH→絮凝的速度→表面積大小→硅膠吸附能力大小其吸附活性取決其含水量：〈1%時，吸附活性最高；〉20%時，吸附活性

22、最低。硅膠的分子內部的水分子，在活化時隨著烘烤的溫度升高，其活化的程度也不斷提高，200-2500C加熱活化時，吸附力最佳。,,,活化 加熱至100～110℃，除去硅膠表面因氫鍵所吸附的水分 當溫度升高至500-1000℃時，硅酰基脫水縮合轉變?yōu)楣柩跬殒I，不再有吸附劑的性質再生: 提高其吸附能力。 一般可用乙醇或甲醇洗滌，除去溶劑，110℃烘干活化處理,吸附介質的分類及其性質（三）,氧化鋁：多孔的A1

23、203的聚合物，吸附性能也可通過改變其含水量加以控制。性質：屬于疏水性吸附介質。分離非極性化合物。優(yōu)點：吸附容量大，分離效果好，價格低。缺點：具有催化性能。堿性條件下不穩(wěn)定的化合物分離時容易發(fā)生諸如異構化、氧化和消除等次級反應原理：被分離的物質與氧化鋁表面的一些羥基形成氫鍵。,,堿性氧化鋁：氫氧化鋁高溫脫水。 pH值約為9.0～10.0，分離碳氫化合物及某些中性或堿性化合物。中性氧化鋁：堿性氧化鋁經一些

24、列處理。 pH約為7.5，分離醛、酮、醌類及核苷類化合物。酸性氧化鋁 ：氧化鋁經一系列處理。 pH值約為4.0，分離酸性色素及醛酸類化合物。,種類及制備,,活化 200℃左右加溫4～6小時再生 棄去柱頂端的加樣部位后，依次用甲醇、稀乙酸、稀氫氧化鈉溶液和水洗滌，再經高溫(200℃)活化,吸附介質的分類及其性質（四）,活性炭原理：活性基團（-OH）與被分離

25、的物質分子中的某些基團產生范德華引力形成吸附。根據材料分：動物炭、植物炭、礦物炭根據顆粒粗細分：粉末活性炭：顆粒較細、吸附容量較大、常用于脫色顆粒活性炭：粒度大、流速快、吸附容量較小錦綸黏合活性炭：吸附能力弱應用可分離水溶性芳香族化合物與脂肪族化合物、氨基酸與肽、單糖與多糖目前，多用于在結晶過程中進行脫色和脫臭等操作中的簡單吸附過程,活性炭,在不同的溶液或溶劑中的吸附能力是不同的在水溶液中吸附能力最強，在有機溶劑中吸附

26、能力較弱；對極性化合物吸附能力較強，非極性的化合物吸附能力較弱；在酸性環(huán)境中吸附能力強；在水中對同系物的吸附量隨著同系物的分子量的增大其吸附量而增加。,吸附介質的分類及其性質（五）,聚丙烯酰胺特點：化學合成的一種極性吸附介質，適合于分離極性化合物，吸附特異性強，分辨率高，吸附容量大，選擇性強，應用廣。原理：聚丙烯酰胺分子中的酰胺基與被分離物質如酚類、酸類、醌類以及硝基化合物等之間的羥基和羧基形成不同強度的氫鍵結合而被吸附。在

27、水中形成氫鍵的能力大于在有機溶劑中對堿較穩(wěn)定，對酸尤其是無機酸穩(wěn)定性較差應用：生物堿、萜類、甾體、糖類、氨基酸等極性與非極性化合物的分離,吸附介質的分類及其性質（六）,聚苯乙烯性質：非極性吸附介質，適于分離在分子中含有硝基、氯原子和酚羥基的化合物；吸附性強（具有較多的穿透孔）、剛性強、流速快、分辨率高。原理：被分離物質分子中的疏水基團與聚苯乙烯之間形成范得華力。,吸附劑的選擇,被分離物質的特性：極性吸附介質、非極性吸附介質。介

28、質的容量：選擇比表面大、吸附容量大的吸附介質。介質的通用性：選擇多功能的吸附介質。介質的穩(wěn)定性：理化性質穩(wěn)定，不與溶劑、洗脫劑、樣品等發(fā)生化學反應。介質的剛性：選擇剛性較強、顆粒度均勻的吸附介質。,上樣劑和洗脫劑的選擇,洗脫劑，上樣劑：溶解被吸附樣品和平衡固定相的溶劑。上樣劑有利于吸附介質對溶質的吸附洗脫劑對樣品有強的解吸附能力,選擇原則,純度較高；對樣品有較好的溶解度（能較完全洗脫所分離的成分）和穩(wěn)定性（不發(fā)生聚合、沉淀、

29、變性和相關的化學反應） ；粘度小；易和所需要的成分分開。對檢測器不敏感（光譜檢測器、電導檢測器、pH檢測器）。,分離過程--吸附過程,吸附過程選用有利于吸附的、洗脫能力弱的溶液作為流動相。影響因素：吸附能力的強弱與溶劑的性質、極性、黏度、離子強度、介質活化的程度、流速、吸附介質的種類、樣品的性質等因素有關。吸附量與吸附特異性的平衡協(xié)調。,分離過程—洗脫過程,柱內的吸附介質與吸附溶質間不斷發(fā)生吸附—解吸附—再吸附—再解吸附的循環(huán)

30、過程。溶質在吸附介質上的吸附有強弱的差異，吸附強的溶質溶解速度慢，解吸附難，保留值大。不同保留值大小的溶質在層析柱內的移動過程中產生了差異。選擇具有較高洗脫能力的洗脫劑作為流動相，吸附能力強的吸附介質采用具有較強的洗脫能力的洗脫劑洗脫。溶劑的極性大，洗脫能力強。溶液的離子強度高，洗脫能力強。,色譜流出曲線及有關術語 流出曲線和色譜峰,,,在層析分離中,當流動相中的溶質分子流過層析柱時,就會在固

31、定相和流動相兩相之間不斷發(fā)生作用。在前進的過程中由于被分離物質的性質不同導致其移動速度也不同,在柱內的滯留時間有差異。當流動相中的各組分在兩相中保留值不同時,它們在層析柱內遷移速度就會產生差異。,隨著層析時間的延長組分與組分之間彼此分離開.最后分別收集各組分.以組分的保留時間為橫坐標,吸光值為縱坐標作圖,得到色譜峰。,基本術語,1. 基線 柱中僅有流動相通過時，檢測器響應訊號的記錄值，穩(wěn)定的基線應該是一條水平直線。,,,,h,

32、,,,Wb,,,,,,,Wb,,,,Wb,,,,,Wb,,,h,,,Wb,,,,h,,,Wb,,,,,h,,,Wb,,,色譜峰頂點與基線之間的垂直距離，以h表示，,2. 峰高,3、區(qū)域寬度,標準偏差δ 即0．607倍峰高處色譜峰寬。峰寬Wb 自色譜峰兩拐點處做切線與基線相交點，這兩點的直線距離。半峰寬W1/2 即峰高一半處對應的峰寬,4. 死時間t0,不被固定相吸附或溶解的物質進入色譜柱時，從進樣到出現(xiàn)峰極大值所需的時間稱為死時間

33、。與固定相填料的空隙體積成正比！,,流動相中的溶質進入層析柱后,不被固定相所吸附,與固定相不發(fā)生任何作用,流過層析柱所收集的體積。包括柱管內固定相顆粒間所剩留的空間、色譜儀中管路和連接頭間的空間以及檢測器的空間的總和．當后兩項很小而可忽略不計時，死體積可由死時間與流動相體積流速F（L／min）計算： V0 = t0·F,5．死體積 V0,6. 保留時間tR,試樣從進樣開始到柱后出現(xiàn)峰

34、極大點時所經歷的時間，稱為保留時間，它相應于樣品到達柱末端的檢測器所需的時間。,從進樣開始到被測組份在柱后出現(xiàn)濃度極大點時所通過的流動相體積。保留體積與保留時間tR的關系如下： VR = tR·F0,7．保留體積 VR,某組份的保留時間扣除死時間后稱為該組份的調整保留時間，即 tR′ = tR-t0,8．調整保留時間tR′,某組份的保留體積扣除死體積后，

35、稱該組份的調整保留體積，即 VR′ = VR- V0,9．調整保留體積VR′,,某組份B的調整保留值與組份A的調整保留值之比，稱為相對保留值。,必須注意，相對保留值絕對不是兩個組份保留時間或保留體積之比 .,10．相對保留值KAB (柱選擇因子),當出現(xiàn)2個以上的峰時，KAB就是選擇性α，最早出現(xiàn)的峰為S峰，后面出現(xiàn)的某個峰為i峰。選擇性α主要決定于固定相性質，其次是色譜柱溫度。α值越大，表示

36、固定相對組分的選擇性越高，則兩組分分離得越開。α等于1時，兩組分重疊。,α= t’R（i） / t‘R（S）=V’R（i）/ V‘R（S）,KAB = t’RB / t‘RA=V’RB/ V‘RA,分配系數(shù):在一定溫度和壓力下，組分在固定相和流動相之間分配達平衡時的 濃度之比值 。分配系數(shù)大的組分在固定相上的溶解或吸附能力強，因此在柱內的移動速度慢。反之，分配系數(shù)小的組分在固定相上的溶解或吸附能力弱，在柱內的移動速度快。分配系數(shù)體現(xiàn)

37、了不同組分的熱力學性質的不同,其大小反映了組分在固定相上的溶解——揮發(fā) 或 吸附——解吸 的能力。,11. 分配系數(shù)K,K=cs / cm,cs ——溶質在固定相的濃度cm——溶質在流動相的濃度,分配系數(shù)K的物理意義,一定溫度下，組分的分配系數(shù)K越大，出峰越慢；試樣一定時，K主要取決于固定相性質；每個組份在各種固定相上的分配系數(shù)K不同；選擇適宜的固定相可改善分離效果；試樣中的各組分具有不同的K值是分離的基

38、礎；某組分的K = 0時，即不被固定相保留，最先流出；分配系數(shù)K與溶質和固定相的熱力學性質有關，與兩相的體積、層析柱的特性無關。,分配系數(shù)K與分離性能,K決定于組分和兩相的熱力學性質。在一定溫度下，K小的組分在流動相中濃度大，先流出色譜柱；反之，后流出色譜柱。兩組分K值之比大，（不是指每一組分的K的絕對值越大），是獲得良好色譜分離的關鍵。分配系數(shù)與溫度成反比，增加溫度，分配系數(shù)變小。在氣相色譜分離中，柱溫是一個很重要的操作參數(shù)，溫

39、度的選擇對分離影響很大，而對液相色譜分離的影響小。,12.分配比K’ (容量因子),分配比是指在一定溫度和壓力下，組分在兩相間分配達平衡時，分配在固定相和流動相中的總質量比。,1. 分配系數(shù)與分配比都是與組分及固定相的熱力學性質有關的常數(shù)，隨分離柱溫度、柱壓的改變而變化。2.分配系數(shù)與分配比都是衡量色譜柱對組分保留能力的參數(shù)，數(shù)值越大，該組分的保留時間越長。分配比與分配系數(shù)的不同在于分配比不但與組分和兩相性質有關，而且還與兩相體積有

40、關,,,,,,,,,b,K,V,V,c,c,V,V,M,V,V,M,M,M,K’,m,S,m,s,m,m,m,S,S,S,m,S,=,×,=,=,=,K=K’β,β——相對比率,,色譜分析基本原理(1),色譜分析的目的是將樣品中各組分彼此分離，組分要達到完全分離，兩峰間的距離必須足夠遠，兩峰間的距離是由組分在兩相間的分配系數(shù)決定的，即與色譜過程的熱力學性質有關。但是兩峰間雖有一定距離，如果每個峰都很寬，以至彼此重疊，還是不能

41、分開。這些峰的寬或窄是由組分在色譜柱中傳質和擴散行為決定的，即與色譜過程的動力學性質有關。因此,要從熱力學和動力學兩方面來研究色譜行為。,,色譜分析基本原理（2）,色譜理論需要解決的問題：色譜分離過程的熱力學和動力學問題，影響分離及柱效的因素與提高柱效的途徑，柱效與分離度的評價指標及其關系。組分保留時間為何不同？色譜峰為何變寬？組分保留時間：色譜過程的熱力學因素控制；色譜峰變寬：色譜過程的動力學因素控制；（兩相中的運動阻力，擴散

42、）兩種色譜理論：都是以層析過程中分配系數(shù)為前提塔板理論:對層析柱的質量的判斷和選擇有指導意義;速率理論:對層析分離條件的選擇具有指導意義.,塔板理論-柱分離效能指標,塔板理論（plate theory）半經驗理論：將色譜分離過程比擬作蒸餾過程，將連續(xù)的色譜分離過程分割成多次的平衡過程的重復（類似于蒸餾塔塔板上的平衡過程）。該理論將一根色譜柱當作一個精餾塔，其中的每一小段色譜柱相當于精餾塔中的一個塔板,從而描述組分在色譜柱內的

43、分配行為。,把色譜柱比作精餾塔，視作由許許多多小段(塔板)組成,且塔板與塔板之間不連續(xù);塔板之間無分子擴散。組分在每塊塔板的兩相間的分配平衡瞬時達到，達到一次分配平衡所需的最小柱長稱為理論塔板高度H。一個組分在每塊塔板上的分配系數(shù)相同。流動相以不連續(xù)的形式加入，即以一個一個的塔板體積加入，連續(xù)的色譜過程視作一個塔板中的兩相平衡過程的重復。組分進入色譜柱后，在每塊塔板上進行兩相間的分配。塔板數(shù)越多，組分在柱內兩相間達到分配平衡的次

44、數(shù)也越多，柱效越高，分離就越好. 理論塔板數(shù)為:,塔板理論假定,理論塔板數(shù),,,由上式可知，組分的保留時間越長，峰寬度越小，則理論塔板數(shù)n越多，色譜柱效能越高。,有效塔板數(shù)和有效塔板高度,單位柱長的塔板數(shù)越多，表明柱效越高。用不同物質計算可得到不同的理論塔板數(shù)。組分在t0時間內不參與柱內分配。需引入有效塔板數(shù)和有效塔板高度：,塔板理論的不足,塔板理論是模擬在一些假設條件下而提出的，假設同實際情況有差距，所以他描述的色譜分配過程的定

45、量關系也有不準確的地方。對于塔板高度H這個抽象的物理量究竟由哪些參變量決定的？H又將怎樣影響色譜峰擴張等一些實質性的較深入的問題，塔板理論卻不能回答。 為什么流動相線速度(U)不同，柱效率(n)不同；而有時當U值由很小一下變得很大時，則柱效能（n）指標并未變化許多，但峰寬各異，這些現(xiàn)象塔板理論也無能為力．塔板理論忽略了組分分子在柱中塔板間的縱向擴散作用，特別當傳質速率很快時，其縱向擴散作用為主導方面，這一關鍵問題并未闡述。塔板理

46、論無法指出影響柱效的因素及提高柱效的途徑。,速率理論,1956年van Deemter等提出了色譜過程動力學理論——速率理論。他們吸收了塔板理論中板高的概念，并充分考慮了組分在兩相間的擴散和傳質過程，從而在動力學基礎上較好地解釋了影響板高的各種因素。該理論模型對氣相、液相色譜都適用。 van Deemter方程的數(shù)學簡化式為,式中u為流動相的線速度；A，B，C為常數(shù)，分別代表渦流擴散項系數(shù)、分子擴散項系數(shù)、傳質阻力項系數(shù)。,A.渦流擴散

47、(Eddy diffusion),A = 2λdp dp：固定相的平均顆粒直徑λ：固定相的填充不均勻因子,固定相顆粒越小dp↓，填充的越均勻，A↓，H↓，柱效n↑。表現(xiàn)在渦流擴散所引起的色譜峰變寬現(xiàn)象減輕，色譜峰較窄。對于空心毛細管，不存在渦流擴散。因此A＝0。,對填充柱有渦流擴散的影響,B. 縱向擴散（longitudinal diffusion）,B = 2rDm r ：彎曲因子，填充柱色譜，r < 1。 Dm：

48、試樣組分分子的擴散系數(shù)（cm3·s-1） (1) 存在著濃度差，產生縱向擴散; (2) 擴散導致色譜峰變寬，H↑(n↓)，分離變差; (3) 分子擴散項與流速有關，流速↓，滯留時間↑，擴散↑;,縱向分子擴散展寬度,r為彎曲因子，它反映了固定相顆粒的幾何形狀對自由分子擴散的阻礙情況,一般小于1。Dm為組分在流動相中擴散系數(shù)。 Dm 隨柱溫升高而增加，與柱壓成反比;Dm 與流動相的相對分子質量M的關系為Dm?M-1

49、/2，故在GC中，若用氫氣作流動相產生的縱向分子擴散要比用氮氣時嚴重。組分在液體中的擴散系數(shù)約為氣體中的1/105,所以在液相色譜中,縱向分子擴散一般可忽略。U為流動相線速度。,如何減小縱向分子擴散?,流動相線速度越高，柱越短，組分在柱內的滯留時間越短，縱向分子擴散程度就越小。欲使縱向分子擴散減少，應選擇球狀顆粒和相對分子質量較大的物質作流動相。柱溫低,縱向分子擴散程度就小。,C. 傳質阻力,試樣組分的分子在兩相中進行溶解、擴散、

50、分配時的質量交換過程，稱為傳質過程；在傳質過程中所受到的阻力叫傳質阻力。  C u =（Cm+C s）u如何減小流動相傳質阻力?采用細顆粒的固定相增大組分在流動相中的擴散系數(shù)適當降低流動相線速選用短柱,速率理論的要點,組分分子在柱內運行的多路徑與渦流擴散、濃度梯度所造成的分子擴散及傳質阻力使氣液兩相間的分配平衡不能瞬間達到等因素是造成色譜峰擴展柱效下降的主要原因。通過選擇適當?shù)墓潭ㄏ嗔６?、載氣種類、液膜厚度及載

51、氣流速可提高柱效。速率理論為色譜分離和操作條件選擇提供了理論指導。闡明了流速和柱溫對柱效及分離的影響。各種因素相互制約，如流速增大，分子擴散項的影響減小，使柱效提高，但同時傳質阻力項的影響增大，又使柱效下降；柱溫升高，有利于傳質，但又加劇了分子擴散的影響，選擇最佳條件，才能使柱效達到最高。,分離度,分離度是既能反映柱效又能反映選擇性的指標，可作為衡量層析柱分離總效能的綜合指標，又稱總分離效能指標或分辨率。,塔板理論和速率理論都難以描

52、述分離物質的實際分離程度。即柱效為多大時，相鄰兩組份能夠被完全分離。 分離物質對分離度大小受色譜過程中兩種因素的綜合影響： 保留值之差──色譜過程的熱力學因素； 區(qū)域寬度──色譜過程的動力學因素。分離度可判斷相鄰兩組份在層析柱內的分離情況.,,R值越大，表明相鄰兩組分分離越好。對于兩個峰高相同的對稱峰，達到基線分離時，Rs=1.5，此時，兩組分的分離程度達99.87%。故常用R=1.5作為相鄰兩組分已完全分離的標

53、志。 Rs＝1時，分離程度可達97.72％(兩個峰高相同)兩峰的高度相差10倍，當Rs=1.0時，低含量組分的分離程度只有88%。,如何判斷完全分離?,,基本色譜分離方程,,柱效的影響 柱長L∝n，柱長? RS?，但分析時間?，且峰寬?。因此為了增高柱效，用減小塔板高度H的辦法比增加柱長要好。2. 分配比的影響 k’ ?, RS?, 但k’值越大，分析時間越長，峰越展寬。通常k’值選在0-10范圍內。改變分配比的方法有：

54、改變柱溫或改變流動相性質和組成，或改變固定相。3. 選擇因子 α越大，柱選擇性越好，對分離越有利?？赏ㄟ^改變固定相的性質和組成或降低柱溫等辦法，提高α。,,,流速對板高的影響,對應某一流速，液相層析和氣相層析都有一個板高的極小值，這個極小值就是柱效的最高點。對于液相層析來說，為了得到好的柱效，就要控制流速。,分子擴散項和傳質阻力與板高的影響,低流速時，分子擴散占主要因素。高流速時，傳質阻力起主要作用。書上圖2-11H=A+

55、B/u+C*uC*u （傳質阻力隨流速增加而增加，影響顯著）AB/u （低流速時，隨流速的升高，分子擴散影響下降迅速）,固定相顆粒大小對板高的影響,渦旋擴散 A=2λdp，固定相顆粒越小，dp↓，A↓，H↓，柱效n↑但顆粒小，流速↓ ，分子擴散B/u就會↑，就得提高柱壓機械強度高，剛性強的填料（HPLC）,凝膠層析,,凝膠層析又稱分子篩過濾、排阻層析等，依據是多孔的載體對不同體積和不同形狀分子的排阻能力的不同，從

56、而對混合物進行分離。,排阻層析(Gel Filtration, GF),定義：利用生物大分子的相對分子質量差異進行層析分離的方法。也稱凝膠層析或分子篩層析特點：20世紀60年代，作為電泳支持介質分離血清中蛋白質；（分子篩作用）球型微珠，用于液相層析分離介質；同時，也作為合成帶有配基的層析介質應用最廣泛的一種載體。設備簡單、操作方便、重復性好、條件溫和。,優(yōu)點：凝膠屬于惰性載體，不帶電荷，吸附力弱，操作條件比較溫和，溫度范圍廣

57、，不需要有機溶劑，分離效果好缺點：樣品被不斷稀釋，上樣量不能太大，否則分辨率變差,凝膠是一種不帶電的具有三維空間的多孔網狀結構的物質，每個顆粒的細微結構及篩孔的直徑均勻一致，小分子可以進入凝膠網孔，而大分子則排阻于顆粒之外。,排阻層析分離原理,大分子物質沿凝膠顆粒間隙隨洗脫液移動，流程短，移動速率快，先被洗出層析柱小分子物質可通過凝膠網孔進入顆粒內部，然后再擴散出來，故流程長，移動速度慢，最后被洗出層析柱,排阻層析分離原理,原理

58、：按生物大分子相對分子量大小分離。小分子可以擴散到凝膠空隙，由其中通過，保留時間長，出峰最慢；中等分子只能通過部分凝膠空隙，中速通過；而大分子被排斥在外，保留時間最短，出峰最快。與普通的篩分原理不同：大顆粒不通過，小顆粒通過。,排阻層析介質分離范圍,分離范圍：全排阻分子：上限分子，不能起篩分作用的大分子。部分滲透分子：也稱分離分子，是凝膠介質有效分離的分子。全滲透分子：下限分子，不能起篩分作用的小分子。,有關參數(shù)的意義,柱床體積

59、（Vt）：層析介質經溶脹、裝柱、沉降、體積穩(wěn)定后，所占層析柱內的總體積。外水體積（Vo）：柱床內凝膠顆粒之外、顆粒之間的空隙所占有的水相體積或溶劑體積。內水體積（Vi）：凝膠吸水溶脹后，存在于凝膠顆粒內所占有的水相體積或溶劑體積。,有關參數(shù)的意義,凝膠體積（Vg）：凝膠顆粒自身的體積，柱床體積減去外水體積和內水體積后所占有的體積。洗脫體積（Ve）：自加樣液時開始，到洗脫組分濃度最大時出現(xiàn)的峰為止，所收集的體積。,各參數(shù)間的關系,V

60、t=Vo+Vi+VgVe=Vo+KdViKd=（Ve-Vo）/ Vi分子在柱中移動的速度取決于該分子在固定相和流動相間的分配系數(shù)Kd，Kd表示某一分子在特定的凝膠柱內的洗脫行為。與被分離物質相對分子質量大小、凝膠顆?？障逗途W狀孔徑大小有關。與層析柱的長短和粗細無關。可通過實驗獲得。,,Kd的意義,Kd=0Ve=Vo, 完全不能進入凝膠內部的大分子，洗脫體積等于外水體積。（全排阻分子，無分離意義）Kd=1Ve=Vo+V

61、i,完全可以進入凝膠內部的小分子，其洗脫體積就等于外水體積和內水體積之和。（全滲透分子，無分離意義）01凝膠具有一定的吸附作用。（ Ve > Vo+Vi）,Ve=Vo 該成分的分子全部被排阻在凝膠顆粒的間隙中， 因而洗脫速度最快。即該成分的Kd＝0。Vi＝Ve-Vo 該成分不被排阻而可完成進入凝膠顆粒內部, 因而洗脫速度最慢。即該成分的Kd=l。Kd值介

62、于0-l之間，物質的洗脫速度隨其Kd值的 增加而降低一般物質的Kd值是0<Kd< l。,洗脫行為可以有三種可能的情況:,凝膠層析介質,基本性質球形顆粒，球內部是多孔網狀結構。需具有化學穩(wěn)定性凝膠介質合成后所保留的化學基團必須具有良好的惰性，不與待分離的物質發(fā)生化學反應，不影響被分離的物質原有的性質（如生物學活性、構象），在比較苛刻的環(huán)境中保持相對的穩(wěn)定性。無特異性吸附凝膠顆粒上

63、不存在或存在極少的離子基團，不與溶液中的離子化合物發(fā)生離子交換、吸附或親和反應，在低離子強度下，洗脫峰不出現(xiàn)脫尾，被分離的物質有較高的回收率。,凝膠層析介質,具有較好的耐受性對有機溶劑和溫度具有較好的耐受性，在高溫下不發(fā)生熔融，在有機溶劑中不發(fā)生收縮變形。具有較好的剛性好具有一定的機械強度，在操作壓力范圍內，柱床體積不發(fā)變化，在層析過程中，流速不發(fā)生改變。,凝膠層析介質分類,葡聚糖凝膠層析介質： Sephadex由多聚葡聚糖通過

64、與環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)而合成的，具有網狀結構的珠狀凝膠顆粒。特性：交聯(lián)度與凝膠顆粒網狀結構孔徑大小有關，交聯(lián)度越大，網狀結構的孔徑越小，分離的分子量就越小。不溶于水和有機溶劑，但具有很強的親水性（羥基）。在酸性條件下糖苷鍵容易被水解，在堿性環(huán)境中較穩(wěn)定。,凝膠層析介質分類,葡聚糖凝膠層析介質在高鹽條件下，體積易收縮，凝膠剛性較差。在氧化劑的作用下，羥基易于被氧化，增加了帶電荷特性，使其非特異性增強。對溫度具有較好的耐受性。（溶脹

65、 1100C、干膠 1200C）SephadexG系列產品：G后面的數(shù)字越大，交聯(lián)度越小，凝膠孔徑越大，分離相對分子質量范圍越大，凝膠溶脹體積大。（P107表2-5）,,,凝膠層析介質分類,瓊脂糖凝膠層析介質：瓊脂糖基本結構由?-D-吡喃半乳糖和3，6-脫水-L吡喃半乳糖相結合而成的鏈狀多糖。特性：一種大孔徑凝膠，具有良好的親水性（羥基）。交聯(lián)度隨著瓊脂的濃度增加而增大。網狀孔徑的大小可通過改變凝膠的交聯(lián)度來控制。,凝膠層析介

66、質分類,瓊脂糖凝膠層析介質瓊脂糖分子中不帶電荷，非特異性吸附較少，回收率較高。經過處理的瓊脂糖凝膠，可耐受較高的溫度，機械強度也較高。SepharoseB產品：B前面的數(shù)字表示瓊脂糖的百分濃度，瓊脂糖的濃度越高表示交聯(lián)度越大，凝膠孔徑越小，相對分子質量分離范圍越小。（P108表2-6）耐受一定的高溫、酸堿度、及變性劑（6M尿素）。,瓊脂糖系列,較常用的是Pharmacia和BioRad兩家的產品，前者生產的稱為Sepharose

67、，后者的產品為BioGel A。BioGel A 系列的產品有不同的顆粒度，有粗、中和細三檔，它們的顆粒度分別為l50μm～300 μm，80μm～150μm和40μm～80μm 。,,,凝膠層析介質分類,聚丙烯酰胺凝膠層析介質：是由丙烯酰胺單體，先制成丙烯基的衍生物，在交聯(lián)劑N，N’-甲叉雙丙烯酰胺（Bis)作用下聚合而成多孔性聚丙烯酰胺凝膠珠。產物也是固體粉末，用前先溶漲。 特性：穩(wěn)定性不如交聯(lián)的葡聚糖凝膠。在酸性條件下酰

68、胺鍵容易被水解生成羧酸，有離子交換作用，使介質的非特異性吸附增加，應避免酸性較強的緩沖液。具有良好的大孔性和機械強度。Bio-GelP產品：P后面的數(shù)字越大，表示交聯(lián)度越小，凝膠孔徑越大，相對分子質量分離范圍越大，凝膠的溶脹體積越大。（P109表2-7）,,凝膠層析介質分類,瓊脂糖-聚丙烯酰胺混合凝膠層析介質：由瓊脂糖-聚丙烯酰胺按不同比例制成的混合型凝膠。聚丙烯酰胺為骨架（剛性好），在其中填充瓊脂糖凝膠剛性好，孔徑大。理