基于納米金探針的全氟化合物生物檢測技術(shù)研究.pdf

1、近年來，全氟化合物（Perfluorinated compounds，PFCs）在工業(yè)生產(chǎn)和生活消費領(lǐng)域中應(yīng)用越來越廣，由此產(chǎn)生的環(huán)境污染問題日趨嚴(yán)重。其中，全氟辛烷磺?；衔铮≒erfluorooctane sulfonates，PFOS）和全氟辛酸（Perfluorooctanoic acid，PFOA）是環(huán)境中最典型、污染最重的，也是多種其他PFCs在環(huán)境中的最終代謝產(chǎn)物。鑒于PFCs的健康危害性，近年來歐美發(fā)達(dá)國家已發(fā)出一系列

2、的關(guān)于PFOS、PFOA等的銷售及使用限令。當(dāng)前PFOS已在相關(guān)出口產(chǎn)品中被廣泛限制，成為繼二惡英之后的又一綠色壁壘。加強對PFCs的檢測是控制這些污染物及防治其健康危害的基礎(chǔ)和必需手段，對我國環(huán)境保護(hù)、居民健康和國民經(jīng)濟發(fā)展具有重要意義。
　　 到目前為止，PFCs的檢測方法主要是化學(xué)分析法，如色譜法。但色譜法檢測過程復(fù)雜、檢測周期長、費用高，適用于要求精確定量的場合。理想的PFCs檢測程序應(yīng)該是先利用一種簡便的方法對待檢樣品

3、進(jìn)行初步的篩選，如果PFCs超過規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，再利用色譜法檢測具體的PFCs。因此，急需建立一種簡便、快速、經(jīng)濟且易于實施的檢測PFCs的新方法，以適應(yīng)大規(guī)模樣本篩查及長期環(huán)境監(jiān)測的需求。
　　 本研究根據(jù)PFCs與PPARα核受體相互作用形成的配體-PPARα/RXR復(fù)合物能與PPARα反應(yīng)元件（PPARαresponse element，PPRE）核酸序列特異性結(jié)合的特性，利用納米金探針以及銀染增強技術(shù)的高靈敏度，借鑒配體受體

4、相互作用和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式反應(yīng)元件的思路，將二者結(jié)合起來，建立一套全新的微量PFCs的快速分析方法，稱為結(jié)合銀染增強的納米金-PPRE探針生物檢測法，簡稱納米金-PPRE探針法。
　　 第一部分 建立納米金-PPRE探針法檢測體系
　　 目的：本部分旨在建立一種新的鑒定PFCs并進(jìn)行定量研究的生物檢測方法——納米金-PPRE探針法，能作為大量樣本的預(yù)篩手段，可廣泛用于基層實驗室。
　　 方法：本研究基于PFCs與

5、PPARα特異結(jié)合的這一特性，利用納米金探針銀染增強技術(shù)的高靈敏度，建立一套全新的微量PFCs的快速分析方法。以最具代表性的PFOS作為研究對象，通過固定anti-PPARα抗體于微孔板上，用PFOS激活PPARα受體形成PFOS-PPARα/RXR復(fù)合體，并加入到微孔板中，然后加入納米金-PPRE探針進(jìn)行檢測；通過檢測與PFOS激活的PPARα結(jié)合的PPRE-納米金顆粒并被銀染增強液增強后的信號來定量檢測PFOS。繪制PFOS濃度與O

6、D值之間的劑量-效應(yīng)關(guān)系曲線。本部分研究對實驗條件進(jìn)行了優(yōu)化，并與標(biāo)準(zhǔn)分析方法高效氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC/MS）進(jìn)行了比較，以及利用該方法檢測了其他的PFCs，如PFOA。
　　 結(jié)果：（Ⅰ）通過Western blot方法檢測肝細(xì)胞核提取產(chǎn)物，驗證了核提取產(chǎn)物中PPARα蛋白的提取效果良好；（Ⅱ）建立時間-劑量-反應(yīng)曲線，確定最佳銀染增強顯色時間為3min；（Ⅲ）定量研究可得到PFOS劑量-效應(yīng)關(guān)系曲線，在一定范圍內(nèi)

7、（100 pM-1μM）PFOS誘導(dǎo)產(chǎn)生效應(yīng)（OD值）與PFOS濃度之間呈良好的線性相關(guān)（R2=0.9582），EC50約為10nM，最低檢測限為10 pM；（Ⅳ）檢測結(jié)果與HPLC/MS比較具有良好的一致性；（ⅴ）利用該方法檢測了其他的PFCs也取得了良好的結(jié)果。
　　 結(jié)論：納米金-PPRE探針法具有靈敏、快速、經(jīng)濟、簡便的特點，儀器設(shè)備方便易操作，結(jié)果與HPLC/MS具有可比性，是一種新穎而實用的檢測PFCs的生物分析方法

8、。
　　 第二部分納米金-PPRE探針法檢測環(huán)境和生物樣本中的全氟化合物
　　 目的：利用納米金-PPRE探針法定性和定量檢測環(huán)境水樣和血清生物樣本中的PFCs。
　　 方法：將采集的水樣和生物樣本分別經(jīng)過一定的前處理過程后，溶于DMSO，然后以PFOS為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)采用納米金-PPRE探針法檢測制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，并同時用納米金-PPRE探針法檢測樣本中PFCs所產(chǎn)生的效應(yīng)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出各組檢測樣本中相當(dāng)?shù)腜FCs的

9、相對含量。檢測結(jié)果與HPLC/MS檢測結(jié)果相比較，并分析其差異原因。本部分同時進(jìn)行了一系列質(zhì)量控制和質(zhì)量保證研究，包括回收率、精密度、準(zhǔn)確性、檢測限、線性范圍等。
　　 結(jié)果：結(jié)果表明納米金-PPRE探針法準(zhǔn)確性、精密度和回收率均較好，檢測限低于HPLC/MS法，檢測線性范圍較寬，基本達(dá)到了生物檢測技術(shù)質(zhì)量控制的要求；對環(huán)境水樣的檢測結(jié)果比HPLC/MS檢測結(jié)果稍高，但在同一個數(shù)量級上，其差異可能是由于一些干擾物質(zhì)造成的；血清樣

10、本的檢測結(jié)果與HPLC/MS法基本一致。
　　 結(jié)論：結(jié)合有效的前處理過程，納米金-PPRE探針法可以快速地用于實際樣本的定性與定量檢測，結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)分析方法具有可比性。
　　 總而言之，納米金-PPRE探針法是一種頗具前景的有效的PFCs生物檢測方法，與標(biāo)準(zhǔn)分析法基本一致的檢測結(jié)果以及其靈敏、快速和經(jīng)濟的特點使它可以作為大量污染站點的預(yù)篩手段。納米金-PPRE探針法既能良好的評價綜合效應(yīng)又能進(jìn)行方便的現(xiàn)場操作，勿需細(xì)