藥物分析供試品前處理與測定方法效能指標

1、第四章 樣品前處理與分析方法驗證,§1. 定量分析樣品的前處理方法 1. 概述,含鹵素藥物,,與芳環(huán)連接,牢固；與脂肪鏈C連接,不牢固。,含金屬 藥物,,金屬鹽或配位化合物,如酒石酸銻鉀等,不牢固；金屬原子直接與碳原子結(jié)合,如卡巴胂,牢固。,2. 不經(jīng)有機破壞的分析方法 (1)直接測定法：金屬原子不直接與碳原子相連，如富馬酸亞鐵； (2)直接回流后水解測定法： 含鹵素藥物 +NaOH?回

2、流?間接銀量法測定(加過量AgNO3再用　NH4SCN返滴定),(3)硫酸水解后測定法(4) 氧化還原后測定法　a. 堿性還原后測定法，如泛影酸的測定,Na I + AgNO3 ? AgI? +NaNO3,+NaI,b. 酸性還原后測定法，如碘番酸的測定　碘番酸 +HAc +Zn? I- ? 銀量法測定,c. 汞齊化法：,,d. 利用藥物中可游離的金屬離子的氧化性測定含量,3. 經(jīng)有機破壞的分析方法,4. HNO3-HClO4

3、 法,適用于血、尿、組織等,4. HNO3-H2SO4 法,不適用于含堿土金屬有機藥物,3. H2SO4 -硫酸鹽法,含砷、銻有機藥物,2. 灼燒（干法） ? 420 0C,1. 氧瓶燃燒法,不適用于含易揮發(fā)性金屬有機藥物,氧瓶燃燒法,,? 硬質(zhì)瓶(測F時用石英瓶)? 稱樣? 先通氧氣后點火? 吸收液(H2O或H2O+NaOH等),碘苯酯,I2(I-),I-,,IO3-,I2,,S2O32- 滴定,三氯叔丁醇,膽影酸,

4、泛影酸,碘他拉酸,碘番酸,碘苯酯,鹽酸胺碘酮,諾氟沙星,醋酸氟輕松,磺溴酞鈉,葡萄糖酸銻鈉,富馬酸亞鐵,酒石酸銻鉀,汞撒利,卡巴胂,§2. 生物樣品分析的前處理技術(shù),目的：,(1) 藥物進入體內(nèi)后，經(jīng)吸收、分布、代謝，然后排出體外。在體 液、組織和排泄物中除了游離型藥物之外，還有藥物的代謝物、 藥物與蛋白質(zhì)形成的結(jié)合物、以及藥物或其代謝物與內(nèi)源性物 質(zhì) (如葡萄糖醛酸、硫酸形成的葡萄糖醛酸苷、硫酸酯綴

5、合物)等 多種形式存在，需要分離后測定藥物及代謝物；(2) 生物樣品的介質(zhì)組成比較復雜，主要影響是蛋白質(zhì)。,,1. 常用樣品的種類、采集和貯藏 1. 血樣?血漿的制備：將采取的血液置含有抗凝劑(肝素、草酸鹽、枸櫞酸鹽、 EDTA、氟化鈉等)的試管中，混合后，以2500?3000rpm 離心5mi

6、n使與血細胞分離，分取上清液即得。,?血清的制備：將采取的血樣在室溫下至少放置30min到1hr，待凝結(jié) 出血餅后，用細竹棒或玻璃棒輕輕地剝?nèi)パ?，然?以2000 ?3000rpm離心分離5 ? 10min，分取上清液即 得。,藥

7、物結(jié)合型,游離型,,,,不能通過血管壁,保存：,4 0C,-20 0C,(1) 唾液,由腮腺、頜下腺、舌下腺和口腔粘膜內(nèi)許多散在的小腺體分泌液混合組成。,? 1.003?1.008 pH 6.2?7.6,,? 不受時間、地點限制，可反復采集? 無痛苦、無危險? 有些唾液中藥物濃度可以反映血漿 中游離型藥物濃度,(2) 尿液,采集方式,,,隨時尿晨尿白天尿夜間尿時

8、間尿,自然排尿,,立即測定，超過24hr應加防腐劑(苯、甲苯、醋酸、濃HCl),2. 生物樣品分析前處理技術(shù) 根據(jù)生物樣品的類型進行分離、純化。如血漿或血清需除蛋白，使藥物從蛋白質(zhì)結(jié)合物中釋放；唾液樣品則主要采用離心沉淀除去粘蛋白；尿液樣品常采用酸或酶水解使藥物從綴合物中釋出，當原型藥物排泄在尿中時，可簡單地用水稀釋一定倍數(shù)后進行測定。,? 樣品處理步驟與分析方法的選擇,(1) 去除蛋白質(zhì)：,a. 加入與水相混溶的有機溶劑

9、，如乙睛、甲醇、乙醇、 丙醇、丙酮、四氫呋喃，使蛋白質(zhì)分子內(nèi)及分子間 的氫鍵發(fā)生變化而使蛋白質(zhì)凝聚，使與蛋白質(zhì)結(jié)合 的藥物釋放出來； b. 加入中性鹽，使溶液的離子強度發(fā)生變化，使蛋白 質(zhì)脫水而沉淀，如飽和硫酸銨、硫酸鈉、鎂鹽、磷 酸鹽及枸櫞酸鹽等；,c. 加入強酸，使蛋白質(zhì)形成不溶性鹽而沉淀，如 10%三氯醋酸，6%高氯酸、硫酸-鎢酸混合液及5% 偏磷酸等； d. 加入

10、含鋅鹽及銅鹽的沉淀劑，分取上清液，如 CuSO4-Na2WO4、ZnSO4-NaOH等； e. 酶解法：加蛋白水解酶中的枯草菌溶素，既可使組 織酶解，又可使藥物析出。,(2) 綴合物的水解：尿中藥物多數(shù)呈綴合狀態(tài) 酸水解（HCl） 酶水解(葡萄糖醛酸苷酶或硫酸酯酶

11、),,(3) 分離、純化與濃集： a. 液-液提取法(乙醚或氯仿) b. 液-固提取法(小規(guī)模的柱色譜法，用青 水性硅藻土和疏水性活性炭、聚苯乙烯等),(4) 化學衍生化： a. 使藥物變成具有能被分離的性質(zhì)；

12、 b. 提高檢測的靈敏度； c. 增強藥物的穩(wěn)定性； d. 提高對光學異構(gòu)體分離的能力。,§3. 測定方法的效能指標,(1) 精密度(Precision):,測定同一勻質(zhì)樣品的一組測量值彼此符合程度,衡量方法,,批內(nèi)精密度 ? 5%

13、批間精密度 ? 15%,(2) 準確度(Accuracy)：測定結(jié)果與真實值接近的程度,,,85 ?115%(樣品濃度?200?g/l)80 ?120%(樣品濃度?200?g/l),(3) 檢測限(Limit of Detection): 指分析方法能夠從背景信號中區(qū)分 出藥物時，所需樣品中藥物的最低

14、 濃度，無需定量測定。,LOD,(4) 定量限(Limit of Quantitation): 指在保證具有一定可靠性(一定準 確度和精密度)的前提下，分析方

15、 法能夠測定出的樣品中藥物的最 低濃度。,LOQ,(5) 選擇性(Selectivity):,指在樣品介質(zhì)中有其他組分共存時該分析方法對供試物質(zhì)準確而專屬的測定能力。,? 專屬性,一種方法僅對一種分析成分產(chǎn)

16、生唯一信號；選擇性則可對多種化學成分產(chǎn)生不同響應，而主要成分的響應可與其他響應區(qū)分。,● 線性與范圍(Linearity and Range): (6) 線性：在給定范圍內(nèi)獲取與樣品中供試物濃度成正比的 試驗結(jié)果的 能力 (7) 范圍：利用同一種方法取得精密度、準確度均符合要求的試驗結(jié)果， 而且成線性的供試物濃度的變化范圍，其最大量與最小

17、量之 間的間隔，可用 mg/l ? mg/ l或 ?g/l ? ?g/l 表示。 Y=a+bx r?0.9900,● 重現(xiàn)性(再現(xiàn)性) (Ruggedness):,不同人、不同實驗室、不同儀器，共同對同一樣品的某物理量進行反復測量，其結(jié)果接近的程度,,? 重復性,同一人、同一實驗室、同一儀器，對同一樣品反復測量，測

18、量值之間接近的程度。,評價其保持不受參數(shù)微小變化影響的能力，并可作為正常使用的一個可靠性指標。,(8) 耐用性(粗放度)(Robustness):,● 與參比方法測得結(jié)果的相關(guān)程度的比較：,? 要求：r ? 0.95 b 1,藥典要求的檢驗項目和驗證內(nèi)容,思考題,1. 以三氯叔丁醇為例說明加熱回流水解法的原理和方法, 加熱回流水解法適用于哪一類含鹵素有機藥物的測定?2. 什么是氧瓶燃燒法？在