藥物分析方法學(xué)驗(yàn)證中各項(xiàng)指標(biāo)的深度剖析

1、藥物分析方法學(xué)驗(yàn)證中各項(xiàng)指標(biāo)的深度剖析,一、線性試驗(yàn),主成分含量測(cè)定 以測(cè)定濃度為100% ，50%~120%之間選取5個(gè)點(diǎn)即可。 溶出（釋放）度測(cè)定 以釋放量的10%～120%間選取5個(gè)點(diǎn)即可。 雜質(zhì)含量用雜質(zhì)對(duì)照品準(zhǔn)確測(cè)定 以雜質(zhì)限度為100% ，50%~120%之間選取5個(gè)點(diǎn)即可。,測(cè)定結(jié)果：1）闡述如何看待截距和斜率、如何應(yīng)用。2）誤差在哪里，應(yīng)用時(shí)的注意事項(xiàng)。3）為什么沒有不成線性

2、的？通常C、H、O、N結(jié)構(gòu)，紫外監(jiān)測(cè)器決定。 個(gè)別化學(xué)鍵所致。梯度洗脫時(shí)，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)不成線性。4）都成線性、為何還要做？最小二乘法的原理知曉。,唑 來 磷 酸 結(jié) 構(gòu) 式,引申使用：1）有關(guān)物質(zhì)測(cè)定 歸一化法和自身對(duì)照法的相互妙用。2）緩釋制劑溶出度測(cè)定，對(duì)照品濃度設(shè)定為中間濃度。舉例說明。3）回收率試驗(yàn)為何做80%~120%即可？亦及樣品濃度與對(duì)照品濃度接近到何等程度的理解。4）國內(nèi)只注重相關(guān)系數(shù)，不注重截距

3、。,二、精密度試驗(yàn),重復(fù)性試驗(yàn)：連續(xù)進(jìn)樣6次。 中間精密度試驗(yàn)和重現(xiàn)性試驗(yàn)通過“耐用性試驗(yàn)中的溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)”來體現(xiàn)。 濃度極低時(shí)才會(huì)不理想，加大進(jìn)樣量。 色譜峰形極為重要，對(duì)稱性、柱效等參數(shù)。加大柱溫、增加流動(dòng)相中有機(jī)相比例，使被測(cè)物質(zhì)峰盡快出峰。,三、準(zhǔn)確度試驗(yàn) 用回收率來衡量,作法：在80%~120%間選擇3點(diǎn)或5點(diǎn)，原因是由外標(biāo)一點(diǎn)法決定的。 已知雜質(zhì)、且有雜質(zhì)對(duì)照品的，可采用加入法，即加樣

4、回收率來評(píng)價(jià)。 一般情況下，只要空白輔料無干擾，回收率均是良好的！,四、專屬性,有關(guān)物質(zhì)為主，其他檢測(cè)項(xiàng)目（含量）基本上均參照有關(guān)物質(zhì)。 有關(guān)物質(zhì)的驗(yàn)證，采用中間體和降解產(chǎn)物（確認(rèn)結(jié)構(gòu)后人工合成）來驗(yàn)證與主成分的分離。,系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的配制方法： 在100％濃度的主成分溶液中加入1%濃度的雜質(zhì)對(duì)照品，以模擬樣品中有可能存在的狀態(tài)。 介紹配制方法 —— 先配制雜質(zhì)貯備液，再用

5、供試品溶液（或濃的對(duì)照品溶液）來稀釋，簡(jiǎn)便、易行！,專屬性試驗(yàn)驗(yàn)證圖譜,存在問題 —— 配制相同濃度，測(cè)定樣品時(shí)，主成分峰驟然加大，將雜質(zhì)峰覆蓋。 強(qiáng)破壞試驗(yàn)的目的： 驗(yàn)證藥品在遭遇了極端的氣候環(huán)境條件下產(chǎn)生的雜質(zhì)，在所建立的色譜條件下是否能夠分離、測(cè)定。,● 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 涉及到各被檢測(cè)物質(zhì)在該波長(zhǎng)下的響應(yīng)因子是否相同，即所謂重量校正因子的問題。（f=A雜質(zhì)/A被測(cè)成分） 選取主成分與各雜質(zhì)具有相同

6、紫外吸收的波長(zhǎng)（f=1.0）。 選取各雜質(zhì)紫外吸收大于主成分紫外吸收的波長(zhǎng)（f>1.0），這樣可更加嚴(yán)格控制雜質(zhì)的限度。 如選取各雜質(zhì)紫外吸收小于主成分紫外吸收的波長(zhǎng)，應(yīng)必須加入重量校正因子（f<1.0），否則將得到錯(cuò)誤的判斷。,介紹該項(xiàng)檢測(cè)的由來和歷史背景 要看主峰里是否有雜質(zhì)，如何判斷？但需注意DAD檢測(cè)器的局限性，介紹“土辦法”！ 結(jié)果：目前從來沒有推翻現(xiàn)行色譜條件的。

7、意義在哪里。如何應(yīng)用，拿到只是“走形式”？,最小峰面積的設(shè)定● 其設(shè)定，不是絕對(duì)值，而是相對(duì)值?！?英國藥典中有明確的說明：凡有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)采用HPLC法測(cè)定時(shí)，均規(guī)定舍棄對(duì)照溶液主峰面積幾分之幾的峰面積。普通樣品測(cè)定時(shí)，通常為1/10~ 1/20（即相當(dāng)于樣品測(cè)定濃度的0.1%~0.05%）。如規(guī)定雜質(zhì)限度為1.0%，對(duì)照溶液峰面積為10000，那么，最小峰面積可考慮設(shè)定為1000~500左右。新藥穩(wěn)定性考核時(shí)，可設(shè)定到0.0

8、1%的最小峰面積。● 原料藥銷售與購買的合同中，為確保雙方達(dá)成一致意見，此點(diǎn)應(yīng)予以重視。,強(qiáng)力破壞試驗(yàn)● 水破壞 取原料適量，加水溶解后，在90℃放置24小時(shí)。● 氧化破壞 取原料適量，用5%過氧化氫溶液溶解后，在90℃放置24小時(shí)。● 強(qiáng)堿破壞 取原料適量，用1mol/L氫氧化鈉溶液溶解后，在90℃放置24小時(shí)?！?強(qiáng)酸破壞 取原料適量，加1mol/L鹽酸溶液溶解后，在90℃放置24小時(shí)。● 高溫破壞 取原

9、料適量，依據(jù)各自品種的熔點(diǎn)不同，在高溫下破壞至外觀性狀改變● 強(qiáng)光破壞 取原料適量，置紫外燈下照射48小時(shí)。,四、檢測(cè)限,● 信噪比的三倍 —— 純屬“紙上談兵”，實(shí)際測(cè)定中根本用不上?！?是相對(duì)值，不是絕對(duì)值。是相對(duì)于供試品溶液濃度的多少分之一而言，一般至少要在5000倍以上。,有關(guān)物質(zhì)、含量與自身對(duì)照三者濃度的關(guān)系,積分參數(shù)的設(shè)定● 積分參數(shù)的設(shè)定是非常重要的。由斜率(Slope)、峰寬(Width)、最小峰面積(

10、Min Area)組成?！?采用自身對(duì)照法時(shí)，對(duì)照溶液與供試品溶液必須在同一斜率、峰寬下進(jìn)行積分計(jì)算?！?供試品溶液最小峰面積的設(shè)定將直接導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果。設(shè)定得太小，會(huì)導(dǎo)致很多小峰甚至是基線漂移的小峰均被積分出作為雜質(zhì)峰，從而導(dǎo)致雜質(zhì)峰面積增加，易判斷為不合格；如設(shè)定得過大，又將反映不出雜質(zhì)情況。,方法學(xué)認(rèn)證中的耐受性試驗(yàn) 是指更換試驗(yàn)因素，如不同人員、不同儀器，不同色譜柱型號(hào)、廠家，不同試劑等因素。這一點(diǎn)才是真正至

11、關(guān)重要的！認(rèn)證時(shí)不可能做到這一點(diǎn)，出現(xiàn)問題時(shí)往往要考慮到。,方法學(xué)認(rèn)證中溶液穩(wěn)定性的全面判定不能單從主成分入手！還要注意所有組分的百分比變化，絕對(duì)值變化！,流速、柱溫與溶劑的選擇● 在測(cè)定時(shí)通常調(diào)節(jié)流速使主成分保留時(shí)間稍長(zhǎng)些，且使主成分峰不拖尾即可。● 柱溫對(duì)分離效果的影響雖有一定的影響，但不甚顯著，如有柱溫箱，通常設(shè)定不超過35℃?！?溶劑的選擇應(yīng)測(cè)定樣品溶液在該溶劑中的穩(wěn)定性來衡量，盡量勿選擇揮發(fā)性強(qiáng)的溶劑；同時(shí)應(yīng)保

12、證對(duì)照溶液的主成分峰面積精密度良好。,質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中制訂有關(guān)物質(zhì)的原則● 采用雜質(zhì)對(duì)照品法、用于降解產(chǎn)物的準(zhǔn)確測(cè)定，如氫氯噻嗪、對(duì)乙酰氨基酚等?！?采用強(qiáng)破壞試驗(yàn)破壞出雜質(zhì)。如中國藥典中的氧氟沙星所有品種，均在HPLC法的色譜條件下擬定了：取供試品溶液，置紫外燈下（254nm）照射4小時(shí)以上，使產(chǎn)生的緊鄰主峰前的雜質(zhì)峰與主峰的分離度應(yīng)符合規(guī)定。● 不采用任何方式。,典型強(qiáng)破壞試驗(yàn)圖譜,藥品含量測(cè)定方法的設(shè)計(jì)——原料藥,原料藥:對(duì)

13、于組份單一的原料藥,首選容量法測(cè)定含量 強(qiáng)調(diào)：（1）供試品的取用量應(yīng)滿足滴定精度的要求（消耗滴定液約20ml）；（2）滴定終點(diǎn)的判斷要明確，如選用指示劑法，應(yīng)考慮其變色敏銳，提供滴定曲線，并用電位法校準(zhǔn)其終點(diǎn)顏色。（3）為排除因加入其它試劑或混入雜質(zhì)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，或便于剩余滴定法的計(jì)算，可采用“將滴定的結(jié)果用空白試驗(yàn)校正”的辦法；（4）最后要給出滴定度（采用四位有效數(shù)字）。,容量法測(cè)定含量要注意參加反應(yīng)的應(yīng)是藥物分

14、子活性部分，而不應(yīng)是次要的酸根或堿基部分。 如鹽酸氨溴索 ，有研究者采用氫氧化鈉滴定液測(cè)定其含量，事實(shí)上這種方法測(cè)定的是其中鹽酸的含量，由于其成鹽工藝中的酸、堿配比不當(dāng)時(shí)，可嚴(yán)重影響成品酸堿度，故測(cè)定結(jié)果并不能代表其活性成分有機(jī)堿的含量 。 應(yīng)采用非水滴定法，以無水冰醋酸為溶劑屏蔽掉鹽酸的干擾，用高氯酸滴定其有機(jī)堿的含量。高氯酸非水滴定法因適應(yīng)性廣（適用于有機(jī)弱堿及其鹽類）在化學(xué)原料藥的含量測(cè)定中較為常用。,如用容量法

15、不適宜時(shí)，可考慮選用HPLC法，尤其在有關(guān)物質(zhì)干擾，或多組份物質(zhì)時(shí)，具有特殊優(yōu)勢(shì)。一般不選用UV法，尤其不首選“吸收系數(shù)法”定量，不選用末端吸收峰作測(cè)定波長(zhǎng)；須用UV法時(shí)，可采用不受儀器及其它變化影響的“對(duì)照品比較法”定量，測(cè)定溶液的吸收度宜在0.3～0.7間。元素測(cè)定法如定氮法，在其它方法均不適宜時(shí)可采用，但因不能反映化合物含量的變化情況，此法不可用于穩(wěn)定性考察中。,藥品含量測(cè)定方法的設(shè)計(jì)——制劑,應(yīng)考慮輔料等的干擾，首選方法

16、一般為HPLC法，在有關(guān)物質(zhì)、輔料不干擾的情況下，也可選用UV法或原料藥項(xiàng)下的容量法 。復(fù)方制劑首選HPLC法 。,藥品含量測(cè)定方法的設(shè)計(jì)——驗(yàn)證,訂入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的含量測(cè)定法不同于一般質(zhì)量考察的方法，須經(jīng)過嚴(yán)格的方法學(xué)驗(yàn)證 。容量分析法的驗(yàn)證：①精密度：用原料藥精制品（含量>99.5%）考察方法精密度，平行試驗(yàn)5個(gè)樣本的RSD≤0.2%；②準(zhǔn)確度：以測(cè)定原料精制品的回收率計(jì)算，應(yīng)在99.7%～100.3%之間（n＝5,RSD≤

17、0.1%）；③滴定終點(diǎn)確定的依據(jù)：包括滴定曲線的繪制，如用指示劑法確定終點(diǎn)，應(yīng)用電位法校準(zhǔn)終點(diǎn)顏色，提供指示劑顏色與電位變化情況的對(duì)比結(jié)果；,④耐用性：考察測(cè)定條件（供試液穩(wěn)定性、樣品提取次數(shù)、時(shí)間等）有微小變動(dòng)時(shí)，測(cè)定結(jié)果不受影響的承受程度，如測(cè)試條件要求苛刻時(shí)則應(yīng)在方法中注明。 HPLC法的驗(yàn)證：①精密度：RSD≤2%（n＝5）；②準(zhǔn)確度：用于制劑時(shí)，要考察輔料的影響，將一定量藥物加到按處方比例配制的輔料中（為標(biāo)示量的80%～1

18、20%）制成高、中、低三個(gè)劑量，混合均勻后，每個(gè)劑量取三份樣品，按擬定方法測(cè)定回收率，應(yīng)在98%～102%之間（n＝9, RSD≤2%）。,③線性范圍：用已知含量的精制品配制一系列濃度的溶液（n＝5～7），用濃度C對(duì)峰面積A或峰高h(yuǎn)或被測(cè)物的響應(yīng)值之比進(jìn)行回歸處理，線性方程的相關(guān)系數(shù)r≥0.9990，截距越小越好，并提供線性關(guān)系圖；④專屬性：輔料、有關(guān)物質(zhì)或降解產(chǎn)物峰對(duì)主藥峰應(yīng)無干擾；⑤耐用性：考察測(cè)定條件（供試液穩(wěn)定性、流動(dòng)相組成

19、和pH值、不同品牌或批號(hào)的同類色譜柱、柱溫、流速、樣品提取次數(shù)、時(shí)間等）有微小變動(dòng)時(shí)，測(cè)定結(jié)果不受影響的承受程度，如測(cè)試條件要求苛刻時(shí)則應(yīng)在方法中注明；⑥靈敏度：作為常量分析法，此項(xiàng)可不作主要要求。,UV法的驗(yàn)證：①精密度：RSD≤1%（n＝5）；②準(zhǔn)確度：方法同HPLC法，回收率應(yīng)在98%～102%之間（n＝9, RSD≤2%），同時(shí)要求輔料、有關(guān)物質(zhì)或降解產(chǎn)物在測(cè)定波長(zhǎng)處無吸收。③線性范圍：用已知含量的精制品配制一系列濃度的溶液