分子診斷復(fù)習(xí)題舊

1、1分子診斷學(xué)復(fù)習(xí)題一、概念1.分子診斷學(xué)分子診斷學(xué):分子診斷學(xué)是以分子生物學(xué)理論為基礎(chǔ)，利用基因和蛋白質(zhì)分析技術(shù)和方法來(lái)研究人體內(nèi)源性或外源性生物大分子體系的存在、結(jié)構(gòu)或表達(dá)調(diào)控的變化，為疾病的監(jiān)測(cè)、診斷、療效判斷和預(yù)后評(píng)估、個(gè)體化治療等提供信息和決策依據(jù)的一門科學(xué)。2.酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISAELISA）:是以抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記為基礎(chǔ)，反應(yīng)完成后加入酶反應(yīng)底物，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的

2、量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，由此進(jìn)行定性或定量分析。3.時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)（時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)（TRFIATRFIA）：是用鑭系稀土元素螯合物鑭系稀土元素螯合物標(biāo)記抗體或抗原，檢測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)的抗原或抗體，用時(shí)間分辨熒光免疫分析檢測(cè)儀測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物中的熒光強(qiáng)度。根據(jù)產(chǎn)物熒光強(qiáng)度和相對(duì)熒光強(qiáng)度的比值，判斷反應(yīng)體系中分析物的濃度，從而達(dá)到定量分析。定量分析。而時(shí)間分辨與酶免、放免相比，因?yàn)樵诩ぐl(fā)光照射后，稀土元素激發(fā)光的最大吸收

3、波與發(fā)射光的最大發(fā)射波長(zhǎng)之間stokes位移最大位移最大；發(fā)光的半衰期長(zhǎng)半衰期長(zhǎng)（102000us），避免了雜光的影響；激發(fā)光譜寬，發(fā)射光譜窄，不必?fù)?dān)心光譜重疊。4.金標(biāo)免疫測(cè)定金標(biāo)免疫測(cè)定:以微孔濾膜為載體，包被已知抗原或抗體，加入待檢標(biāo)本后，經(jīng)濾膜的毛細(xì)管作用使標(biāo)本中的抗體或抗原與膜上包被的抗原或抗體結(jié)合，再通過(guò)膠體金或超順磁性納米微粒結(jié)合物達(dá)到檢測(cè)目的。5.PCRRFLP(PCRRFLP(限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性)

4、:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)—限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)（PCR—RFLP）分析技術(shù)是在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。DNA堿基置換正好發(fā)生在某種限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)上，使酶切位點(diǎn)增加或者消失，利用這一酶切性質(zhì)的改變，PCR特異擴(kuò)增包含堿基置換的這段DNA，經(jīng)某一限制酶切割，再利用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，與正常比較來(lái)確定是否變異。應(yīng)用PCR—RFLP，可檢測(cè)某一致病基因已知的點(diǎn)突變，進(jìn)行直接基因診斷，也可以此為遺傳標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析進(jìn)行間接基因診斷。用特定

5、的限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)目的用特定的限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)目的DNADNA分子進(jìn)行消化，得到的酶切片斷其大小分子進(jìn)行消化，得到的酶切片斷其大小和數(shù)量可以在一定程度上反映出目的和數(shù)量可以在一定程度上反映出目的DNADNA分子的序列信息。分子的序列信息。診斷遺傳病和傳染病病原體基因分型診斷遺傳病和傳染病病原體基因分型6.PCRSSCP(單鏈構(gòu)象多態(tài)性):聚合酶鏈反應(yīng)單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析，是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種基因分析方法。PCRSSCP分析技術(shù)是一種

6、DNA單鏈凝膠電泳技術(shù)，它根據(jù)形成不同構(gòu)象的等長(zhǎng)DNA單鏈在中性聚丙烯酰胺凝膠中的電泳遷移率變化來(lái)檢測(cè)基因變異。不同構(gòu)象的單鏈不同構(gòu)象的單鏈DNADNA的遷移率不同，相同長(zhǎng)度的的遷移率不同，相同長(zhǎng)度的DNADNA單鏈由于其堿基順序不同單鏈由于其堿基順序不同而形成不同的構(gòu)象，在電泳時(shí)表現(xiàn)出不同的遷移率。可以檢測(cè)出突變位點(diǎn)的存而形成不同的構(gòu)象，在電泳時(shí)表現(xiàn)出不同的遷移率?？梢詸z測(cè)出突變位點(diǎn)的存在。在。用于分析癌基因和等位基因的突變，檢測(cè)遺傳

7、病、免疫性疾病、傳染性疾病的用于分析癌基因和等位基因的突變，檢測(cè)遺傳病、免疫性疾病、傳染性疾病的基因突變。基因突變。7.SouthernblotSouthernblot:將待檢測(cè)的DNA分子用不用限制性內(nèi)切酶消化后，通過(guò)瓊脂糖凝膠3二、思考題1.1.標(biāo)記免疫分析技術(shù)的種類及常用標(biāo)記物。標(biāo)記免疫分析技術(shù)的種類及常用標(biāo)記物。種類：酶聯(lián)免疫吸附分析，免疫熒光分析，放射免疫分析，化學(xué)發(fā)光免疫分析，電化學(xué)發(fā)光免疫分析，金標(biāo)免疫分析，時(shí)間分辨熒光免

8、疫分析常見(jiàn)示蹤物:酶、放射性核素、鑭系稀土元素螯合物、發(fā)光劑2.2.ELISAELISA技術(shù)類型及應(yīng)用。技術(shù)類型及應(yīng)用。技術(shù)類型:雙抗體夾心法測(cè)抗原，雙抗原夾心法測(cè)抗體，間接法測(cè)抗體，競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體，競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原，捕獲包被法測(cè)抗體，BASELISA法應(yīng)用:(1)在醫(yī)學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用：病原體及其抗體的檢測(cè)蛋白質(zhì)的檢測(cè)非肽類激素的檢測(cè)藥物的檢測(cè)毒品檢測(cè)(2)在食品檢測(cè)中的應(yīng)用：食品微生物的檢測(cè)食品毒素的檢測(cè)食品中殘留農(nóng)藥的檢測(cè)食品中殘留抗生素的

9、檢測(cè)轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)3.3.雙脫氧終止法測(cè)序的原理。雙脫氧終止法測(cè)序的原理。利用DNA聚合酶，以單鏈DNA為模板，以dNTP(含標(biāo)記的dNTP)為底物，在四組互相獨(dú)立的反應(yīng)體系中分別加入不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNPT)作為鏈反應(yīng)終止劑，根據(jù)堿基配對(duì)原則，在測(cè)序引物引導(dǎo)下，合成四組有序梯度的互補(bǔ)DNA鏈，然后通過(guò)高分辨率的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，放射自顯影檢測(cè)后直接識(shí)讀待測(cè)DNA的序列。4.4.PCRPCR的基本原理及應(yīng)用。的基本

10、原理及應(yīng)用。原理:是模擬體內(nèi)DNA半保留復(fù)制過(guò)程，通過(guò)變性、退火、延伸三步反應(yīng)的循環(huán)完成；靶基因的雙鏈DNA通過(guò)變性解鏈為單鏈，特異的引物通；過(guò)退火與單鏈DNA模板結(jié)合，在靶DNA的指導(dǎo)下引物的3’末端延伸靶DNA的互補(bǔ)鏈完成一個(gè)循環(huán)，重復(fù)這一過(guò)程，使目的DNA片段得到擴(kuò)增。應(yīng)用:目的基因的克??；基因的體外突變；DNA和RNA的微量分析；DNA序列測(cè)定；基因突變分析5.5.熒光定量熒光定量PCRPCR的原理。的原理。熒光定量PCR（FQ

11、PCR）基于熒光能量傳遞技術(shù)（fluescenceresonanceenergytransferFRET），通過(guò)受體發(fā)色團(tuán)之間偶極偶極相互作用，能量從供體發(fā)色團(tuán)轉(zhuǎn)移到受體發(fā)色團(tuán)，轉(zhuǎn)移效率與兩個(gè)發(fā)色團(tuán)之間距離的6次冪倒數(shù)成比例，受體熒光染料發(fā)射出的熒光訊號(hào)強(qiáng)度與DNA產(chǎn)量成正比，檢測(cè)PCR過(guò)程的熒光訊號(hào)便可得知靶序列初始濃度。6.6.熒光定量熒光定量PCRPCR技術(shù)（技術(shù)（FQPCRFQPCR）在）在HBVHBV檢測(cè)中的應(yīng)用。檢測(cè)中的應(yīng)用