免疫熒光原位雜交的原理應(yīng)用

1、熒光原位雜交技術(shù)熒光原位雜交技術(shù)編輯編輯熒光原位雜交技術(shù)（FluescenceinsituhybridizationFISH）是根據(jù)已知微生物不同分類級(jí)別上種群特異的DNA序列，以利用熒光標(biāo)記的特異寡聚核苷酸片段作為探針，與環(huán)境基因組中DNA分子雜交，檢測(cè)該特異微生物種群的存在與豐度。1特點(diǎn)編輯原位雜交的探針按標(biāo)記分子類型分為放射性標(biāo)記和非放射性標(biāo)記。用同位素標(biāo)記的放射性探針優(yōu)勢(shì)在于對(duì)制備樣品的要求不高，可以通過(guò)延長(zhǎng)曝光時(shí)間加強(qiáng)信號(hào)強(qiáng)度

2、，故較靈敏。缺點(diǎn)是探針不穩(wěn)定、自顯影時(shí)間長(zhǎng)、放射線的散射使得空間分辨率不高、及同位素操作較繁瑣等。采用熒光標(biāo)記系統(tǒng)則可克服這些不足，這就是FISH技術(shù)。熒光原位雜交技術(shù)FISH技術(shù)作為非放射性檢測(cè)體系，具有以下優(yōu)點(diǎn)1、熒光試劑和探針經(jīng)濟(jì)、安全；2、探針?lè)€(wěn)定，一次標(biāo)記后可在兩年內(nèi)使用；3、實(shí)驗(yàn)周期短、能迅速得到結(jié)果、特異性好、定位準(zhǔn)確；4、FISH可定位長(zhǎng)度在1kb的DNA序列，其靈敏度與放射性探針相當(dāng)；5、多色FISH通過(guò)在同一個(gè)核中顯

3、示不同的顏色可同時(shí)檢測(cè)多種序列；6、既可以在玻片上顯示中期染色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)的變化，也可以在懸液中顯示間期染色體DNA的結(jié)構(gòu)。缺點(diǎn)：不能達(dá)到100%雜交，特別是在應(yīng)用較短的cDNA探針時(shí)效率明顯下降。2簡(jiǎn)介編輯1969年，Gall和Pardue等首次將同位素探針用于原位雜交實(shí)驗(yàn)，獲得成功。1987年，染色體原位抑制雜交法的創(chuàng)建，使FISH技術(shù)得以迅速發(fā)展。隨后，Cremer等用生物素和汞或氨基乙酰熒光素等非放射性物質(zhì)標(biāo)記探針，創(chuàng)立了雙色F

4、ISH技術(shù)。1990年，Nederlof等用3種熒光素成功探測(cè)出了3種以上的靶位DNA序列，從而宣告了多色FISH技術(shù)的問(wèn)世。FISH技術(shù)是一種非放射性分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，其基本原理是將直接與熒光素結(jié)合的寡聚核苷酸探針或采用間接法用生物素、地高辛等標(biāo)記的寡聚核苷酸探針與變性后的染色體、細(xì)胞或組織中的核酸按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則進(jìn)行雜交，經(jīng)變性—退火—復(fù)性—洗滌后即可形成靶DNA與核酸探針的雜交體，直接檢測(cè)或通過(guò)免疫熒光系統(tǒng)檢測(cè)，最后在熒光顯

5、微鏡下顯影，即可對(duì)待測(cè)DNA進(jìn)行定性、定量或相對(duì)定位分析。FISH技術(shù)有以下幾點(diǎn)優(yōu)勢(shì)：①安全、快速、靈敏度高；②探針能較長(zhǎng)時(shí)間保存；③多色標(biāo)記，簡(jiǎn)單直觀；④可用于中期染色體及間期細(xì)胞的分析；⑤可應(yīng)用于新鮮、冷凍或石蠟包埋標(biāo)本以及穿刺物和脫落細(xì)胞等多種物質(zhì)的檢測(cè)。3原理編輯基本原理熒光原位雜交技術(shù)問(wèn)世于70年代后期，其曾多用于染色體異常的研究，近年來(lái)隨著FISH所應(yīng)用的探針鐘類的不斷增多，特別是全Cos探針及染色體原位抑制雜交技術(shù)的出現(xiàn)，

6、使FISH技術(shù)不僅在細(xì)胞遺傳學(xué)方面，而且還廣泛應(yīng)用于腫瘤學(xué)研究，如基因診斷基因定位等。原有的放射性同位素原位雜交技術(shù)存在著較多缺點(diǎn)，諸如每次檢驗(yàn)均需重新標(biāo)記探針，已標(biāo)記的探針表現(xiàn)出明顯的不穩(wěn)定性，需要較和時(shí)間的曝光時(shí)間和對(duì)環(huán)境的污染等。在觀察結(jié)果時(shí)，需要較多的分裂進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。此外，由于放射性銀粒和染色體聚集的不同平面，可能引起計(jì)數(shù)上的誤差等。與之比FISH則具有①操作操作簡(jiǎn)便探針標(biāo)記后穩(wěn)定一次標(biāo)記后可使用二年.②方法敏感能迅速得到結(jié)

7、果.③在同一標(biāo)本上可同時(shí)檢測(cè)幾種不同探針.④不僅可用于分裂期細(xì)胞染色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)變化的研究而且還可用于間期細(xì)胞的染色體數(shù)量及基因改變的研究。熒光原位雜交技術(shù)是一種重要的非放射性原位雜交技術(shù)。它的基本原理是:如果被檢測(cè)的染FISH的臨床應(yīng)用在細(xì)胞遺傳學(xué)檢查中，重復(fù)序列的探針應(yīng)用最多，它們是α衛(wèi)星DNA、β衛(wèi)星DNA和經(jīng)典衛(wèi)星DNA探針。α衛(wèi)星DNA探針主要檢測(cè)人染色體的著絲粒。β衛(wèi)星DNA位于頂端著絲粒染色體及號(hào)染色體的異染色體質(zhì)周圍.經(jīng)

8、典衛(wèi)星DNA(classicsaielliteDNA)有著AATGG短片段重復(fù)，位于染色體1、9、15、16和Y染色體長(zhǎng)臂異染色質(zhì)周圍。后兩種探針除去可用于染色體數(shù)目檢查外，還可用于上述部位精細(xì)改變的檢查。三種探針產(chǎn)生的熒光信號(hào)都在染色體著絲?；蚋?，因此常用于鑒定，羊水細(xì)胞可不培養(yǎng)直接作FISH檢查，發(fā)現(xiàn)在21三體Down氏綜合片）18三體（Edward綜合征），13體（Patau綜合征），45、XO(turner氏綜合征)和47XXY

9、（Klinfelter綜合征）。FISH在白血病方面和應(yīng)用較為方泛的是慢性粒細(xì)胞白血病bcrabl易位DNA探針，采用Digoxigenin標(biāo)記于22號(hào)染色體上的bcr基因，用Biotin標(biāo)記位于9號(hào)染色體上的Abl基因，然后用紅綠二種不同顏色的熒光素檢測(cè)，慢料常有染色體易位t(922)(q34q11)而引起bcr和Abl基因的融合，這時(shí)不需要檢測(cè)分裂中期細(xì)胞，在間期細(xì)胞中就可以見(jiàn)到二種顏色訊號(hào)的混合，從而可以確定是Ph陽(yáng)性細(xì)胞。這特別

10、適合化療后緩解的CML，極易發(fā)現(xiàn)殘存的白血病細(xì)胞。其它如t（15；17）易位DNA探針，t（18；21）易位DNA探針?lè)謩e可用于急性早幼粒白血?。ˋPL）和急性粒細(xì)胞白血?。ˋML）的診斷。此外在白血病的診斷方面，還有等位17號(hào)染色體長(zhǎng)臂iso(17q)16號(hào)染色體長(zhǎng)臂間倒位inv(16)探針等，都有商業(yè)出售。在實(shí)體腫瘤方面，應(yīng)用較為廣泛的是HER2neu基因探針。乳腺癌細(xì)胞中Her2neu基因的擴(kuò)增常預(yù)示著患者預(yù)后較差。在FISH技術(shù)

11、之前的所有測(cè)定基因擴(kuò)增的方法，都是采用經(jīng)典的分子生物學(xué)方法Southblotting等），但這些方法與FISH相比，不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且也不可能在細(xì)胞水平上觀察到基因擴(kuò)增的狀態(tài)。FISH技術(shù)的更大優(yōu)點(diǎn)是可以在間期細(xì)胞核上觀察到DNA擴(kuò)增的直接證據(jù)，而且間期細(xì)胞核所顯示出的護(hù)增DNA熒光信號(hào)其數(shù)量多少及熒光強(qiáng)度常與DNA擴(kuò)增的水平有關(guān)。1998年美國(guó)政府FDA批準(zhǔn)了作為基因治療的一種單克隆抗體Herceptin)，可配合化療來(lái)治療部分晚期轉(zhuǎn)

12、移性乳腺癌病人，約2530%的乳腺癌病人有HER2neu基因的擴(kuò)增和或過(guò)度表達(dá)。這部分病人適合Herceptin治療、FDA在此前一些時(shí)候批準(zhǔn)了Vysis公司的HER2neu基因DNA探針在乳腺癌臨床診斷上的應(yīng)用。HER2neu基因的擴(kuò)增或過(guò)表達(dá)也見(jiàn)于卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、涎腺腫瘤及胃癌等惡性腫瘤。可以預(yù)，在不久的將來(lái)Herceptin和HER2neu基因DNA探針可用于這些腫瘤的治療和診斷。其它一些實(shí)體瘤的腫瘤的腫瘤基因的探針如Nmyc

13、CmycCyclinD1等雖有商業(yè)出售，但目前還未用于臨床。FISH在細(xì)胞遺傳學(xué)研究的應(yīng)用染色體xy2118和13的數(shù)量變化常與先天性疾病有關(guān)。采用染色體著絲粒重復(fù)序列DNA作為探針，可以確定分裂細(xì)胞或間期細(xì)胞這些染色體的數(shù)目止，如采用21號(hào)染色體的涂抹(painting)探針，根據(jù)標(biāo)記區(qū)域的大小可檢測(cè)出Down氏綜合征的發(fā)生。實(shí)體腫瘤的染色體研究比較困難，這是由于獲取足夠量的分裂期腫瘤細(xì)胞比較困難。使用染色體著絲特異探針，對(duì)間期細(xì)胞進(jìn)

14、行染色體數(shù)量變異分析，可獲得較好的結(jié)果。因此FISH技術(shù)十分有助于腫瘤細(xì)胞遺傳細(xì)胞遺傳學(xué)的研究。Hopman采用FISH技術(shù)研究膀胱癌，發(fā)現(xiàn)9號(hào)染色體的丟失。FISH檢測(cè)的結(jié)果與流式細(xì)胞儀分析的結(jié)果完全一致。Waldman等發(fā)現(xiàn)染色體數(shù)目的改變和腫瘤的分化及分期有著密切關(guān)系，如7號(hào)染色體嗇常見(jiàn)于有較高的Brdard分級(jí)和有較高的PCNA標(biāo)記指數(shù)的晚期、惡性度高的腫瘤.Waldman認(rèn)為這一現(xiàn)象可涉及到7號(hào)染色體上某些特殊基因的表達(dá)增加或