免疫熒光原位雜交的原理應用

1、熒光原位雜交技術(shù)熒光原位雜交技術(shù)編輯編輯熒光原位雜交技術(shù)（FluescenceinsituhybridizationFISH）是根據(jù)已知微生物不同分類級別上種群特異的DNA序列，以利用熒光標記的特異寡聚核苷酸片段作為探針，與環(huán)境基因組中DNA分子雜交，檢測該特異微生物種群的存在與豐度。1特點編輯原位雜交的探針按標記分子類型分為放射性標記和非放射性標記。用同位素標記的放射性探針優(yōu)勢在于對制備樣品的要求不高，可以通過延長曝光時間加強信號強度

2、，故較靈敏。缺點是探針不穩(wěn)定、自顯影時間長、放射線的散射使得空間分辨率不高、及同位素操作較繁瑣等。采用熒光標記系統(tǒng)則可克服這些不足，這就是FISH技術(shù)。熒光原位雜交技術(shù)FISH技術(shù)作為非放射性檢測體系，具有以下優(yōu)點1、熒光試劑和探針經(jīng)濟、安全；2、探針穩(wěn)定，一次標記后可在兩年內(nèi)使用；3、實驗周期短、能迅速得到結(jié)果、特異性好、定位準確；4、FISH可定位長度在1kb的DNA序列，其靈敏度與放射性探針相當；5、多色FISH通過在同一個核中顯

3、示不同的顏色可同時檢測多種序列；6、既可以在玻片上顯示中期染色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)的變化，也可以在懸液中顯示間期染色體DNA的結(jié)構(gòu)。缺點：不能達到100%雜交，特別是在應用較短的cDNA探針時效率明顯下降。2簡介編輯1969年，Gall和Pardue等首次將同位素探針用于原位雜交實驗，獲得成功。1987年，染色體原位抑制雜交法的創(chuàng)建，使FISH技術(shù)得以迅速發(fā)展。隨后，Cremer等用生物素和汞或氨基乙酰熒光素等非放射性物質(zhì)標記探針，創(chuàng)立了雙色F

4、ISH技術(shù)。1990年，Nederlof等用3種熒光素成功探測出了3種以上的靶位DNA序列，從而宣告了多色FISH技術(shù)的問世。FISH技術(shù)是一種非放射性分子遺傳學實驗技術(shù)，其基本原理是將直接與熒光素結(jié)合的寡聚核苷酸探針或采用間接法用生物素、地高辛等標記的寡聚核苷酸探針與變性后的染色體、細胞或組織中的核酸按照堿基互補配對原則進行雜交，經(jīng)變性—退火—復性—洗滌后即可形成靶DNA與核酸探針的雜交體，直接檢測或通過免疫熒光系統(tǒng)檢測，最后在熒光顯

5、微鏡下顯影，即可對待測DNA進行定性、定量或相對定位分析。FISH技術(shù)有以下幾點優(yōu)勢：①安全、快速、靈敏度高；②探針能較長時間保存；③多色標記，簡單直觀；④可用于中期染色體及間期細胞的分析；⑤可應用于新鮮、冷凍或石蠟包埋標本以及穿刺物和脫落細胞等多種物質(zhì)的檢測。3原理編輯基本原理熒光原位雜交技術(shù)問世于70年代后期，其曾多用于染色體異常的研究，近年來隨著FISH所應用的探針鐘類的不斷增多，特別是全Cos探針及染色體原位抑制雜交技術(shù)的出現(xiàn)，

6、使FISH技術(shù)不僅在細胞遺傳學方面，而且還廣泛應用于腫瘤學研究，如基因診斷基因定位等。原有的放射性同位素原位雜交技術(shù)存在著較多缺點，諸如每次檢驗均需重新標記探針，已標記的探針表現(xiàn)出明顯的不穩(wěn)定性，需要較和時間的曝光時間和對環(huán)境的污染等。在觀察結(jié)果時，需要較多的分裂進行統(tǒng)計學分析。此外，由于放射性銀粒和染色體聚集的不同平面，可能引起計數(shù)上的誤差等。與之比FISH則具有①操作操作簡便探針標記后穩(wěn)定一次標記后可使用二年.②方法敏感能迅速得到結(jié)

7、果.③在同一標本上可同時檢測幾種不同探針.④不僅可用于分裂期細胞染色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)變化的研究而且還可用于間期細胞的染色體數(shù)量及基因改變的研究。熒光原位雜交技術(shù)是一種重要的非放射性原位雜交技術(shù)。它的基本原理是:如果被檢測的染FISH的臨床應用在細胞遺傳學檢查中，重復序列的探針應用最多，它們是α衛(wèi)星DNA、β衛(wèi)星DNA和經(jīng)典衛(wèi)星DNA探針。α衛(wèi)星DNA探針主要檢測人染色體的著絲粒。β衛(wèi)星DNA位于頂端著絲粒染色體及號染色體的異染色體質(zhì)周圍.經(jīng)

8、典衛(wèi)星DNA(classicsaielliteDNA)有著AATGG短片段重復，位于染色體1、9、15、16和Y染色體長臂異染色質(zhì)周圍。后兩種探針除去可用于染色體數(shù)目檢查外，還可用于上述部位精細改變的檢查。三種探針產(chǎn)生的熒光信號都在染色體著絲?；蚋?，因此常用于鑒定，羊水細胞可不培養(yǎng)直接作FISH檢查，發(fā)現(xiàn)在21三體Down氏綜合片）18三體（Edward綜合征），13體（Patau綜合征），45、XO(turner氏綜合征)和47XXY

9、（Klinfelter綜合征）。FISH在白血病方面和應用較為方泛的是慢性粒細胞白血病bcrabl易位DNA探針，采用Digoxigenin標記于22號染色體上的bcr基因，用Biotin標記位于9號染色體上的Abl基因，然后用紅綠二種不同顏色的熒光素檢測，慢料常有染色體易位t(922)(q34q11)而引起bcr和Abl基因的融合，這時不需要檢測分裂中期細胞，在間期細胞中就可以見到二種顏色訊號的混合，從而可以確定是Ph陽性細胞。這特別

10、適合化療后緩解的CML，極易發(fā)現(xiàn)殘存的白血病細胞。其它如t（15；17）易位DNA探針，t（18；21）易位DNA探針分別可用于急性早幼粒白血?。ˋPL）和急性粒細胞白血?。ˋML）的診斷。此外在白血病的診斷方面，還有等位17號染色體長臂iso(17q)16號染色體長臂間倒位inv(16)探針等，都有商業(yè)出售。在實體腫瘤方面，應用較為廣泛的是HER2neu基因探針。乳腺癌細胞中Her2neu基因的擴增常預示著患者預后較差。在FISH技術(shù)

11、之前的所有測定基因擴增的方法，都是采用經(jīng)典的分子生物學方法Southblotting等），但這些方法與FISH相比，不僅費時費力，而且也不可能在細胞水平上觀察到基因擴增的狀態(tài)。FISH技術(shù)的更大優(yōu)點是可以在間期細胞核上觀察到DNA擴增的直接證據(jù)，而且間期細胞核所顯示出的護增DNA熒光信號其數(shù)量多少及熒光強度常與DNA擴增的水平有關(guān)。1998年美國政府FDA批準了作為基因治療的一種單克隆抗體Herceptin)，可配合化療來治療部分晚期轉(zhuǎn)

12、移性乳腺癌病人，約2530%的乳腺癌病人有HER2neu基因的擴增和或過度表達。這部分病人適合Herceptin治療、FDA在此前一些時候批準了Vysis公司的HER2neu基因DNA探針在乳腺癌臨床診斷上的應用。HER2neu基因的擴增或過表達也見于卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、涎腺腫瘤及胃癌等惡性腫瘤?？梢灶A，在不久的將來Herceptin和HER2neu基因DNA探針可用于這些腫瘤的治療和診斷。其它一些實體瘤的腫瘤的腫瘤基因的探針如Nmyc

13、CmycCyclinD1等雖有商業(yè)出售，但目前還未用于臨床。FISH在細胞遺傳學研究的應用染色體xy2118和13的數(shù)量變化常與先天性疾病有關(guān)。采用染色體著絲粒重復序列DNA作為探針，可以確定分裂細胞或間期細胞這些染色體的數(shù)目止，如采用21號染色體的涂抹(painting)探針，根據(jù)標記區(qū)域的大小可檢測出Down氏綜合征的發(fā)生。實體腫瘤的染色體研究比較困難，這是由于獲取足夠量的分裂期腫瘤細胞比較困難。使用染色體著絲特異探針，對間期細胞進

14、行染色體數(shù)量變異分析，可獲得較好的結(jié)果。因此FISH技術(shù)十分有助于腫瘤細胞遺傳細胞遺傳學的研究。Hopman采用FISH技術(shù)研究膀胱癌，發(fā)現(xiàn)9號染色體的丟失。FISH檢測的結(jié)果與流式細胞儀分析的結(jié)果完全一致。Waldman等發(fā)現(xiàn)染色體數(shù)目的改變和腫瘤的分化及分期有著密切關(guān)系，如7號染色體嗇常見于有較高的Brdard分級和有較高的PCNA標記指數(shù)的晚期、惡性度高的腫瘤.Waldman認為這一現(xiàn)象可涉及到7號染色體上某些特殊基因的表達增加或