制備色譜技術(shù)與操作資料

1、制備色譜技術(shù)與操作制備色譜技術(shù)與操作1制備色譜到底是什么？請介紹一下制備色譜？答；有些搞分析色譜的朋友，對制備色譜這個名詞比較陌生。其實，在化學(xué)化工醫(yī)藥等廣泛采用的層析法以及薄層色譜就是最為典型的制備色譜。下面對制備色譜中的一些常用概念做一下介紹。（1）分析色譜的目的，是分析出混合物中一個（或者幾個）純物質(zhì)的含量。制備色譜的目的，是從混合物中得到純物質(zhì)。為了加快分離的時間與提高分離的效率，制備色譜的的進樣品量很大，導(dǎo)致制備色譜柱子的分離

2、負荷的相應(yīng)加大，也就必須加大色譜柱填料，增大制備色譜的直徑和長度，使用的相對多的流動相。然而，當色譜柱上樣品負載加大的時候，往往導(dǎo)致柱效急劇下降而得不到純的產(chǎn)品。制備色譜，要解決容量與柱子效果之間的矛盾，對重現(xiàn)性也要考慮。從經(jīng)濟上來說。制備色譜要爭取少用填料，少用溶劑，要盡可能多的得到產(chǎn)品。（2）樣品的前處理：制備色譜柱子由于處理的樣品多，比分析柱子更容易受污染，所以，必要的前處理就顯得非常的必要。萃取、過濾、結(jié)晶、固相萃取等簡單的分離

3、方法，如果用得上，而且還不是很麻煩，就要盡可能多的采用以去掉雜質(zhì)。（3）制備色譜柱的材質(zhì)及其特點。下面介紹一下，制備色譜柱常用的材質(zhì)及其特點。各種規(guī)格的玻璃柱子在實驗室里頭很容易得到，而且價格低廉，但玻璃柱子致命的弱點是它能承受的壓力很小，且非常容易破碎。當由于壓力太小而導(dǎo)致流動相流速很慢的時候，高位液面或加高壓空氣（或者氮氣）的采用是一個簡單的解決辦法。在底下加真空，也能在一定程度上解決這個問題。不銹鋼柱子具有良好的耐腐蝕、抗壓力性能

4、，但其價格相對很貴。如果，只有很小的分離任務(wù)且經(jīng)費也允許，市面上直徑為1cm的小型制備柱就是首選。有機玻璃柱子也能抗壓力耐腐蝕，相對不銹鋼柱子而言，它是半透明的，可以看到液體的運行狀態(tài)，對有色的物質(zhì)其特點就更為突出。（4）固定相的選擇：硅膠、鍵合固定相（如C18）、離子交換樹脂、聚酰胺、氧化鋁、凝膠等都可以作為色譜柱的填料。有不少文獻報道，對填料可以進行一下處理提高了分離效果，如，對硅膠進行的硝酸銀（或緩沖液）處理。（5）裝柱方法的選擇

5、根據(jù)固定相顆粒度和柱子的尺寸，采用不同的裝柱方法，往往裝填越好分離效果越好。裝柱效果跟填料的顆粒度關(guān)系很大，顆粒度的減少會導(dǎo)致裝柱的難度。一般來說，顆粒直徑小于20－30um的固定相采用濕法裝填。所謂“敲擊－裝填”技術(shù)適用于顆粒直徑大于25um的固定相。濕法的目的是迫使相對稀松的固定相懸漿以高速裝入色譜柱子，從而減少空隙的形成。然而，當柱直徑大于20mm，所加壓力為30－40bar時，高壓懸漿裝填技術(shù)就變得十分復(fù)雜。為將小顆粒固定相裝入

6、更大得制備型色譜柱，可采用柱長壓縮技術(shù)。這種方法，先將固定相懸漿（或偶爾是干填充物）裝入柱中加壓，利用物理方法將其壓緊。壓緊的方法有兩種：徑向壓縮和軸向壓縮。濕法裝柱需要一定的設(shè)備，在柱子填完后，應(yīng)用有柱效的測量，對柱效低的柱子應(yīng)該重填。（6）流動相的選擇：除了和分析色譜同樣的考慮外，在選用流動相時，要考慮色譜分離后面加有旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)等二次分離操作。一般來說，不宜采用高毒性溶劑，對多元溶劑要盡可能的少用。如果產(chǎn)品中含有大量溶劑，溶劑的純度也

7、要考慮在其中。（7）加樣的方法：可以采用以下方法之一進樣。－用注射器進樣－用旋轉(zhuǎn)閥進樣－通過六通閥進樣－通過主泵進樣－通過輔泵進樣－固體上樣（8）泵的選用：生產(chǎn)制備色譜泵的廠商很多。根據(jù)有無脈沖、能承受的最大壓力、控制的精度、售后服務(wù)等來選擇泵。析一下多肽含多少雜質(zhì)，設(shè)置緩緩的梯度的分離樣品，在根據(jù)分析柱子跑出的峰形，逐漸放大純化的方法。4問：TFA在緩沖液中是不是只起到調(diào)節(jié)pH的作用呢？TFA的濃度越高基線的漂移越厲害，那是不是說它的

8、濃度在緩沖液pH允許的情況下越低越好呢？（1）TFA起到類似離子對的作用，一般濃度在0.050.1%，過高的濃度，會使溶液偏酸，長時間使用可能影響柱子壽命。（2）同時TFA可以抑制硅膠表面硅醇基，改善堿性化合物的峰型。有時0.1%TFA分離不好的話?？梢钥紤]加大濃度到0.2%。但要注意用完后及時沖洗色譜柱。（3）走梯度時，因為走成基線漂移，但對制備的影響不大。5問：樣品如果溶解度太低如何上制備HPLC？（1）了解一下樣品的性質(zhì)根據(jù)其酸堿

9、性極性等性質(zhì)，通過調(diào)節(jié)溶劑的pH值等以達到較好的溶解度（2）樣品可能某種晶型難溶，這樣可以加入其他溶劑（如丙酮等）以助溶。（3）不是一定要用流動相來溶解樣品，對溶解度差的樣品，可以選擇甲醇，THF或DMSO等溶解樣品。特別是DMSO，對一般的化合物溶解度都很好。并且在反相柱上不保留，不會造成干擾。而且DMSO的洗脫能力很弱，一般不會影響峰型。（4）可以固體上樣。6問：多肽的分離制備如何上量？如何增大分離度反相HPLC應(yīng)當是很好的分離小肽

10、方法，用CH3CN或CH3OH：H2O（95：5）做流動相，看保留如何，若無保留，建議改用其他色譜方法進行分離。關(guān)于多肽的分離，首先要知道它的分子量大小，然后選擇不同類型的填料，如孔徑的大小。我們先在分析柱（4.6MM內(nèi)徑）上做一下實驗找到最大的分離度這一過程的難度是最大的要不斷地改變流動相和固定相然后再線性或非線性放大到制備放大的倍數(shù)按分析柱的實驗結(jié)果。分離后可以通過冷凍干燥得到固體。還可以考慮離子交換來分離多肽。7問：做柱層析時（國

11、產(chǎn)大孔吸附樹脂），怎么才能把洗脫液中的樹脂殘留物處理干凈？大孔吸附樹脂在上使用前，一般需要進行處理，方法包括用色譜純的甲醇或乙睛洗到?jīng)]有吸收；或樹脂用乙醇浸泡2天，丙酮浸泡2天，然后用常規(guī)的酸，堿洗。再用丙酮回流二小時就可以用了。8問：由分析型液相轉(zhuǎn)為制備型液相，其色譜系統(tǒng)需作多大調(diào)整？是否可以按照柱體積折算只改變流速？其上樣量多大為宜？（1）泵要換，流量要加大，壓力可不變或減少；流通池要換體積更大的。（2）整個系統(tǒng)的管路要更換更粗的，

12、否則壓力太大而且特別容易發(fā)生堵塞。對流通池后的管路，最好增加反壓調(diào)節(jié)器，否則管路太短的話，反壓小會導(dǎo)致流通池氣泡，管路長的話會導(dǎo)致峰展寬。（3）檢測器的響應(yīng)時間和峰寬要設(shè)置合適，否則會導(dǎo)致收集時延遲體積的計算不準(4)上樣量主要根據(jù)柱子的大小、樣品的濃度、制備是否根據(jù)分析條件放大（例如制備柱是否還用分析用填料）；一般上樣量與柱子直徑的平方以及長度成正比。9問：流動相中含有鹽時，收集液該如何除鹽？選用揮發(fā)性酸，堿或鹽（如醋酸銨）是否會在揮