生物色譜技術(shù)

1、生物色譜技術(shù),,因?yàn)橛型瑢W(xué)沒有學(xué)習(xí)過色譜，我們大概介紹一下色譜技術(shù)的起源。色譜技術(shù)最初就是俄國的植物學(xué)家茨維特發(fā)明的。1906年，茨維特在研究植物色素的過程中，做了一個經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)：在一根玻璃管的狹小一端塞上一小團(tuán)棉花，在管中填充沉淀碳酸鈣，這就形成了一個吸附柱。然后將其與吸濾瓶連接，使綠色植物葉子的石油醚抽取液自柱中通過。結(jié)果植物葉子中的幾種色素便在玻璃柱上展開：留在最上面的是兩種葉綠素；綠色層下面接著葉黃素；隨著溶劑跑到吸附層最下層的

2、是黃色的胡蘿卜素。這樣吸附柱成了一個有規(guī)則的與光譜相似的色層。然后把該潮濕的吸附柱從玻璃管中推出，依色層的位置用小刀切開，于是各種色素就得以分離。再用醇為溶劑將色素溶解出來，即得到了各成分的純?nèi)芤?，由此?shí)現(xiàn)了色素的分離和制備。1903年，他將這一研究成果發(fā)表在華沙的《生物學(xué)雜志》上，這就是有關(guān)色譜法的第一篇研究論文。但當(dāng)時他用俄文寫的報(bào)告未能引起人們的興趣，一直到他死后威爾施塔特重新介紹了這種方法時，他的工作才受到了人們的注意。,色譜法

3、,3,1903 – Mikhail Tswett defines the Science of Chromatography,Chromatography Inventor M. S. Tswett(茨維特),生物色譜法,生物色譜法（Biochromatography）是20世紀(jì)80年代中后期問世，由生命科學(xué)與色譜分離技術(shù)交叉形成的一種極具發(fā)展?jié)摿Φ男屡d色譜技術(shù)。,細(xì)胞膜色譜法,親和色譜法,常規(guī)色譜法,固定相含有生物大分子,固定相和研

4、究對象都是生物大分子,研究對象是生物大分子,4,細(xì)胞膜色譜,Cell Membrane Chromatography, CMC,將細(xì)胞膜結(jié)合到硅膠表面，制成細(xì)胞膜固定相，利用色譜學(xué)技術(shù)研究流動相中藥物與受體相互作用規(guī)律的受體動力學(xué)新方法。,特點(diǎn)：分離 + 活性篩選 合二為一 適合于天然藥物活性成分的篩選及藥物作用機(jī)理的研究。,5,舉例,α1A腎上腺素受體高表達(dá)細(xì)胞膜色譜,a：酚妥拉明,b：5-羥色胺,c：甲氧明,d：

5、羥甲唑啉,6,親和色譜,Affinity Chromatography，AC 利用生物大分子具有對某一類生物大分子特異性識別和可逆結(jié)合的特性而建立起來的一種分離方法，也叫做生物親和或生物特異性親和色譜。,親和識別 ： 抗體-抗原 酶-底物 激素-受體,7,IgG蛋白,8,親和色譜分離原理,,2. 配體與目標(biāo)物吸附；,3. 洗脫目標(biāo)物；,1. 找與底物專一可逆結(jié)合的配體, 將配

6、體通過共價(jià)鍵偶聯(lián)到載體。,9,4. 親和柱再平衡。,親和體系,10,核酸結(jié)合蛋白,11,,A蛋白,12,從A型金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)分離而得的一種細(xì)胞壁蛋白。可與人類大多數(shù)類型的IgG(IgG3除外)的Fc段結(jié)合，但很少或幾乎不與人類的IgM結(jié)合。用于免疫分析和IgG的提純。,葡萄球菌A蛋白(Staphylococcal protein A,SPA),免疫球蛋白 A（immunoglobu

7、lin A， IgA）,已有研究證明，呼吸道分泌液中SigA 含量的高低直接影響呼吸道粘膜對病原體的抵抗力，兩者呈正相關(guān)。1. 與病毒或細(xì)菌毒素結(jié)合，從而阻止它們進(jìn)入或破壞細(xì)胞；2. 附著在細(xì)菌的鞭毛上，讓其活動性減弱，并且更容易被巨噬細(xì) 胞吞噬.,,親和色譜純化抗體原理,,13,親和色譜分離示意圖,14,親和色譜的固定相,無機(jī)氧化物：SiO2、Al2O3、ZrO3生物聚合物：纖維素、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖、葡聚

8、糖等。,固定相,1. 載體 （support，又稱基體matrix）,15,特異性配體,生物素－親和素、抗原－抗體、酶－抑制劑、激素－受體,通用性配體,凝集素－各種糖蛋白，核酸－RNA、RNA－蛋白質(zhì),2. 配位體 （ligand，又稱底物 substrate）,親和色譜的固定相,16,親和色譜的固定相,① 脂肪族有機(jī)物或多肽、蛋白組成；② 具有雙官能團(tuán)，一端連接載體，一端偶聯(lián)配體；③ 長度直接影響固定相的立體效應(yīng)；④ 可在對載體

9、進(jìn)行化學(xué)改性的時候形成；⑤ 可具有疏水性或親水性。,3. 間隔臂 （spacer或spacer arms）,小分子物質(zhì)作為配基，載體和配基間插入一個“手臂”以消除空間障礙。,17,親和色譜的洗脫方式,18,階梯式梯度,線性梯度,影響洗脫過程的因素,1. 離子強(qiáng)度：提高離子強(qiáng)度，親和作用減弱或完全破壞。2. pH值：在適當(dāng)?shù)膒H下，親和結(jié)合作用較高，在其它pH下，　　　　　親和作用減弱或完全破壞。3. 離液劑：脲和鹽酸胍的存在可減

10、弱親和作用。4. 溫度：提高溫度，靜電作用、氫鍵、配位鍵減弱；　　　　疏水性相互作用增強(qiáng)。5. 液體離子：SCN-、I-、CIO4-的存在，疏水性相互作用減弱。6. 螯合劑：影響配位鍵，使親和作用消失,19,中壓液相色譜儀,北京東西分析儀器有限公司LC-5600系列常（中）壓生化制備液相色譜儀,20,GE公司,舉例,21,常規(guī)色譜,親和柱,22,反相色譜法,水 + 乙腈,23,反相色譜分離多肽,24,反相色譜分離多肽重現(xiàn)性,,

11、重現(xiàn)性好！,25,反相色譜分離蛋白,,26,體積排阻色譜,分子量大的先被洗脫出來，分子量小的后被洗脫出來。,原理：是按分子大小順序進(jìn)行分離的一種色譜方法， 體積大的分子不能滲透到凝膠孔穴中去而被排阻，較早的淋洗出來；中等體積的分子部分滲透；小分子可完全滲透入內(nèi)，最后洗出色譜柱。,27,28,體積排阻色譜,離子交換色譜,原理：利用被分離組分與固定相之間發(fā)生離子交換能力的差 異來實(shí)現(xiàn)分離。,29,陽離子交換樹脂

12、 大都含有磺酸基(-SO3H)、羧基(-COOH)或苯酚基(-C6H4OH)等酸性基團(tuán)，其中的氫離子能與溶液中的金屬離子或其他陽離子進(jìn)行交換。,2R-SO3H+Ca2+----(R-SO3)2Ca+2H+,硬水軟化原理,離子交換色譜,30,陰離子交換樹脂 大都含有季胺基[-N(CH3)3OH]、胺基(-NH2)或亞胺基(-NH2)等堿性基團(tuán)。它們在水中能生成OH-離子，可與各種陰離子起交換作用。,R-N(CH3) 3O