一種檢測(cè)遺傳毒性物質(zhì)的熒光生物傳感器的構(gòu)建.pdf

1、水環(huán)境中的有毒有害人工合成有機(jī)污染物主要來(lái)源于各種點(diǎn)源排放途徑匯集到水體。其中許多已經(jīng)被證實(shí)即使在極其微量的情況下也會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生諸如致突變、致癌、破壞生殖、干擾內(nèi)分泌等危害。同時(shí)部分水中有機(jī)污染物具有高生物富集性與環(huán)境高滯留性,對(duì)人類健康產(chǎn)生嚴(yán)重的負(fù)面影響。由于水中有機(jī)污染物常以混合的方式聯(lián)合作用于人體,其遺傳毒性與致癌性之間存在一定的相關(guān)性,所以,常通過(guò)檢測(cè)水中混合有機(jī)物的遺傳毒性來(lái)評(píng)價(jià)其對(duì)人體健康的影響。
　　 檢測(cè)水體遺傳

2、毒性的方法很多,但是真正通過(guò)驗(yàn)證的方法很少,不超過(guò)10種,特別是快速的成熟、可靠檢測(cè)方法更少。為了高效、快速檢測(cè)水中遺傳毒性,本研究通過(guò)基因工程的手段,構(gòu)建了一種靈敏度高的檢測(cè)遺傳毒性物質(zhì)的微生物發(fā)光傳感器,并優(yōu)化了其檢測(cè)性能。
　　 用PCR的方法分別擴(kuò)增出強(qiáng)啟動(dòng)子Pcda和編碼綠色熒光蛋白EGFP的基因,用PCR方法把兩者連接起來(lái),與載體P-20連接構(gòu)建成重組質(zhì)粒PSK-EGFP,經(jīng)測(cè)序比對(duì)后,轉(zhuǎn)化到鼠傷寒沙門氏菌TA153

3、5得到重組工程菌株。采用紫外光激發(fā)和熒光顯微鏡觀察,菌體發(fā)出綠色熒光,表明重組發(fā)光工程菌構(gòu)建成功。分別對(duì)培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、pH和不同細(xì)胞密度等影響反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。先測(cè)定了12h的生長(zhǎng)曲線,重組發(fā)光細(xì)菌在2-8 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,為實(shí)驗(yàn)反應(yīng)最佳時(shí)間。對(duì)不同培養(yǎng)溫度比較,發(fā)現(xiàn)30℃培養(yǎng)的相對(duì)37℃熒光強(qiáng)度更高,響應(yīng)關(guān)系較好。不同初始pH值反應(yīng)條件優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)以純凈水作為培養(yǎng)條件的熒光強(qiáng)度pH6.5比pH7.0高,響應(yīng)關(guān)系較好。對(duì)不同初始OD

4、值培養(yǎng)條件進(jìn)行對(duì)比,當(dāng)OD600為0.8左右時(shí),響應(yīng)關(guān)系為最好。
　　 利用不同陽(yáng)性物質(zhì)對(duì)重組發(fā)光細(xì)菌進(jìn)行了敏感度的測(cè)試。用絲裂霉素C(MMC)進(jìn)行濃度梯度測(cè)試,發(fā)現(xiàn)重組發(fā)光細(xì)菌對(duì)MMC的響應(yīng)最好,在10-1-10-6由μg/ml濃度范圍內(nèi),其熒光強(qiáng)度隨著濃度的增加而增加。當(dāng)濃度低至10-6μg/ml范圍,其相對(duì)熒光強(qiáng)度2左右,達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異水平,表明重組發(fā)光細(xì)菌TA1535的對(duì)MMC的最低檢測(cè)濃度為10-6μg/ml。對(duì)4

5、-NQO的濃度梯度測(cè)試,發(fā)現(xiàn)在濃度10-1.-10-4μg/ml濃度范圍內(nèi),其熒光強(qiáng)度隨著濃度的增加而增強(qiáng)。當(dāng)濃度為0.1μg/ml時(shí),響應(yīng)最好。當(dāng)濃度為10-4μg/ml,熒光強(qiáng)度和1μg/ml基本一致,其相對(duì)熒光強(qiáng)度低于1.5,其響應(yīng)較差。我們得出4-NQO濃度10-4μg/ml重組發(fā)光細(xì)菌的檢測(cè)下限。敵克松的濃度梯度測(cè)試結(jié)果,發(fā)現(xiàn)重組發(fā)光細(xì)菌對(duì)敵克松響應(yīng)較差,當(dāng)濃度為3μg/ml時(shí),敵克松誘導(dǎo)綠色熒光蛋白表達(dá)達(dá)到最大,其相對(duì)熒光強(qiáng)