常規(guī)石蠟制片he染色技術(shù)

1、光鏡下觀察組織標(biāo)本需克服的幾個(gè)問(wèn)題,如何保持組織標(biāo)本取材前的形態(tài)？ 如何制備薄組織片，允許光的通過(guò)而便于 觀察？ 如何使不同組織結(jié)構(gòu)具有不同的光折射 率，便于對(duì)標(biāo)本進(jìn)行結(jié)構(gòu)的仔細(xì)辨別？,光鏡標(biāo)本的基本制作技術(shù),第二章,光鏡樣本的基本制作技術(shù)（組織制片技術(shù)）是醫(yī)學(xué)研究和生物學(xué)研究中，觀察細(xì)胞、組織的正常或病理形態(tài)變化的一種必不可少的手段，借此可以彌補(bǔ)活體觀察的不足 同時(shí)光鏡樣本的基本制作技術(shù)

2、也是其它光鏡標(biāo)本技術(shù)的基礎(chǔ),取材 固定 漂洗 脫水 透明 浸蠟 包埋 切片 脫蠟 染色 脫水 透明 封片,,,,,,,,,,,,,光鏡樣本的制作的基本過(guò)程,第一節(jié) 取材及固定,醫(yī)學(xué)研究的組織樣本來(lái)源 人體（最好

3、） 臨床的活檢組織 尸檢組織 （取材方法及注意事項(xiàng)按病理學(xué)要求進(jìn)行） 正常組織 用正常動(dòng)物的組織材料替代,一、動(dòng)物致死法,動(dòng)物的福利，3R原則 動(dòng)物致死法選擇 致死動(dòng)作應(yīng)迅速,1．?dāng)囝^法 2．擊頭法 3．麻醉法4．股動(dòng)脈放血法 5．空氣栓塞法,動(dòng)物致死方法,細(xì)胞標(biāo)本制備,1. 印

4、片法 2. 穿刺法 3. 沉淀法 4. 培養(yǎng)細(xì)胞標(biāo)本制備,二、取材及注意事項(xiàng),1．材料保持新鮮2．組織塊免受擠壓3．組織塊力求小而薄 4．盡量保持組織的原有形態(tài)5．選取好組織塊的切面 6．動(dòng)物品種的選擇和熟悉取材的解剖位置7．切除不需要的部分8．保持材料的清潔,三、組織固定法,固定是使要觀察的組織構(gòu)造盡量接近它取材前的狀態(tài),（一）固定目的 1．標(biāo)本不發(fā)生離開(kāi)身體后或死后變化

5、 2．隨后處理中，標(biāo)本不易損壞 3. 組織塊硬化 4．使組織內(nèi)各種結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不同的折光 率，或?qū)θ玖暇哂胁煌挠H和力,（二）固定方法 1．蒸氣固定法（較細(xì)小而薄的標(biāo)本） 2．小塊組織固定法（直接投入固定液中） 3．注射、灌注固定法（體積過(guò)大或固定 液極難滲入內(nèi)部

6、的組織標(biāo)本） （1）局部灌注固定（肺、肝、腎、腦等） （2）全身灌注固定 （小鼠、大鼠、兔、 狗、猴、人） 4. 微波固定法,灌注過(guò)程 充分暴露心臟 針尖插入左心室或升主動(dòng)脈中 快速灌注生理鹽水 剪開(kāi)右心耳（或右心房）放血

7、 換灌固定液，先快后慢輸入,用量 1. 生理鹽水 大鼠需用80-100ml、兔150-200ml、 貓200-250ml、猴300-500ml、 狗800-1000ml 2. 固定液 動(dòng)物血液量的2倍

8、 動(dòng)物體重（g）×7%×20（ml）,無(wú)論是局部灌注固定，還是全身灌注固定，在灌注完畢后，必須立即將組織塊、器官或整個(gè)動(dòng)物再放入同樣的固定液中進(jìn)行后固定,1．組織塊不宜過(guò)大 2．軟組織或較大塊組織可先經(jīng)2~3小時(shí)固定后，再修整成小塊重投入新配制的固定液內(nèi)繼續(xù)固定 3．固定液的量是組織塊大小的5-20倍為宜，在固定組織的瓶底墊上脫脂棉、數(shù)層紗布或?yàn)V紙 4．固定時(shí)

9、間的長(zhǎng)短視固定劑的種類、溫度、組織塊的大小而定,（三）固定注意事項(xiàng)及影響因素,1．甲醛（福爾馬林）：商品甲醛的濃度是37% ~ 40%的甲醛水溶液。常用甲醛的固定液濃度是10%，而實(shí)際甲醛濃度只有4% 固定小塊組織(15×15×2mm)10小時(shí)左右 經(jīng)它長(zhǎng)期固定的組織，需經(jīng)24~48小時(shí)的自來(lái)水流水沖洗,四、固定液 （一）單純固定液,甲醛單純固定液的常用配方

10、10%甲醛水溶液 37%-40%甲醛液 10ml 自來(lái)水或蒸餾水 90ml 10%甲醛生理鹽水溶液 37%-40%甲醛液 10ml 氯化鈉 0. 85g

11、 自來(lái)水或蒸餾水 90ml,2．多聚甲醛：一種滲透速度極快的甲醛聚合物，在熱水中可解聚成甲醛單體而溶解，在接近水的沸點(diǎn)時(shí)溶解極快；也可溶解于弱堿中。多聚甲醛溶液實(shí)際上是新配制的甲醛液，宜臨用前配制,4%多聚甲醛單純固定液的常用配方 多聚甲醛 4g

12、 蒸餾水（或0.2 mol/L PB） 50ml 在通風(fēng)櫥內(nèi)加熱使之完全溶解，然后冷卻 0.2 mol/L PB（或蒸餾水） ～100ml,3．戊二醛：一種常用的醛類固定劑，能較好的保存組織結(jié)構(gòu)，但其穿透力弱，作為單純固定液多用于電鏡技術(shù)中。市售的戊二醛是25%的溶液，使用時(shí)需配制成1%~6%的不同濃度,4．酒精：?jiǎn)渭児潭ㄒ簽?0%~95%的

13、濃度，不必水洗而直接脫水。多用于組織化學(xué)中的糖原固定 酒精固定的組織易變硬和發(fā)脆、組織收縮較大，所以不易長(zhǎng)時(shí)間停留其中（70%酒精除外） 可作為配制混合固定液的基本成分,5 ．其它固定液 丙酮 苦味酸 醋酸 重鉻酸鉀 三氯醋酸 鉻酸

14、 氯化汞 鋨酸,用多種具有固定作用的試劑混合配制的固定液，達(dá)到各試劑在固定作用中具有的優(yōu)缺點(diǎn)平衡目的,（二）混合固定液,常用混合固定液,1．酒精-甲醛液（A-F 液） 95%或無(wú)水酒精（A） 90ml 37%~40%甲醛液（F） 10ml 2

15、．Carnoy液 冰醋酸 10ml 氯仿 30ml 無(wú)水酒精

16、 60ml3．Bouin 液 飽和苦味酸水溶液 75ml 甲醛液（37%~40%） 25ml 冰醋酸 5ml,4．Helly 液

17、 重鉻酸鉀 2.5g 升汞 5g 蒸餾水 100ml （以上是Helly儲(chǔ)存液）

18、 甲醛液(37%~40%) (臨用時(shí)加入) 5ml 5．1%多聚甲醛-1.25%戊二醛固定液 多聚甲醛 1g 蒸餾水 50ml 在通風(fēng)櫥內(nèi)加熱使之完全溶解，然后冷卻

19、 25%戊二醛 5ml 0.2 mol/L PB（pH 7.4） ～100ml,第二節(jié) 固定后處理及切片,一、組織修整 固定結(jié)束后，將受擠壓或不需要的部分組織修切或整形，同時(shí)選擇好包埋面，稱組織修整。修整可在沖洗前、也可放在沖洗后,二、組織洗滌,洗去滲入組織內(nèi)的固定液，再進(jìn)行

20、下一步驟的操作；否則會(huì)妨礙染色效果，或引起沉淀、結(jié)晶而影響觀察，也可能會(huì)繼續(xù)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)造成后道操作困難 1．水洗滌法：凡用水配制、或含鉻、鋨等的固定液所固定的組織塊，需用水洗滌 2．酒精洗滌法：凡用酒精、或酒精混合液、或含有苦味酸等固定液固定的組織塊，多采用酒精洗滌,三、組織脫水,（一）脫水意義與脫水劑 因水和石蠟不能相溶，而組織經(jīng)固定及水洗后含有水分，所以不能直接用石蠟進(jìn)行包埋。需用某

21、些溶劑逐步置換組織塊中的水分，稱脫水 脫水劑必須具有下列特性：1）脫水劑能與水按任意比例混合；2）脫水劑高濃度時(shí)不含水分；3）脫水劑也能與透明劑按任意比例互相混合,脫水劑中最常用的是酒精。 一般從70%酒精開(kāi)始脫水，逐步升高酒精濃度；脫水時(shí)間根據(jù)組織塊的種類、大小、及使用的固定液種類等因素而定,70%酒精 2~5小時(shí)(可長(zhǎng)期保存組織) 80%酒精

22、 2~5小時(shí) 90%酒精 2~5小時(shí) 95%酒精（Ⅰ） 2~5小時(shí) 95%酒精（Ⅱ） 2~5小時(shí) 無(wú)水酒精（Ⅰ） 30分鐘 無(wú)水酒精（Ⅱ） 30分鐘 無(wú)水酒精（Ⅲ） 30分鐘,（二）脫水步驟和時(shí)間 以18mm×18mm，厚約2~3m

23、m的組織塊 為例，其脫水步驟和參考時(shí)間如下,（三）脫水注意事項(xiàng) 1．組織脫水必須掌握由低濃度逐步 過(guò)渡到高濃度的原則 2．脫水時(shí)間要適度 3．組織脫水要徹底干凈,四、透明,（一）透明意義及透明劑 組織脫水后，內(nèi)部?jī)H含脫水劑，但大多數(shù)脫水劑不能與石蠟相溶，石蠟仍不能浸入組織內(nèi)進(jìn)行包埋和切片。為此，需要一種既能溶于脫水劑又能溶于包埋劑

24、（石蠟）的溶劑，以便逐步將脫水劑置換成包埋劑。這一過(guò)程往往使組織呈半透明狀，故稱透明 二甲苯為石蠟包埋法中最常用的透明劑；它透明能力強(qiáng)，但易使組織收縮、變脆，故組織塊的透明時(shí)間不宜太長(zhǎng)，小組織塊以30分鐘為宜，較大組織塊適當(dāng)延長(zhǎng)但不超過(guò)2小時(shí),（二）透明步驟和時(shí)間 為了減少組織塊過(guò)度收縮，往往在無(wú)水酒精之后，先經(jīng)過(guò)酒精和二甲苯的混合液，然后再浸入純二甲苯中 透明步驟和時(shí)間大致如下

25、 1．無(wú)水酒精:二甲苯=1:1 20~30分鐘 2．二甲苯（Ⅰ） 20~30分鐘 3．二甲苯（Ⅱ） 20~30分鐘,（三）透明注意事項(xiàng) 二甲苯必須保持無(wú)水 組織塊脫水過(guò)程要徹底,五、浸蠟,（一）浸蠟?zāi)康?浸蠟是將透明過(guò)的組織塊在熔化

26、的石蠟中浸漬的過(guò)程。目的是用石蠟代替組織塊中的二甲苯，在隨后溫度下降中，使較軟的組織塊變成有一定硬度的組織蠟塊，以便切片機(jī)切片,第1杯熔蠟(軟蠟)(熔點(diǎn)54℃以下) 1小時(shí) 第2杯熔蠟(硬蠟)(58~60℃) 1小時(shí) 第3杯熔蠟(硬蠟)(58~60℃) 30分鐘 整個(gè)浸蠟時(shí)間控制在3小時(shí)之內(nèi) 浸

27、蠟在恒溫箱中進(jìn)行，且恒溫箱溫度高 于石蠟熔點(diǎn) 2~3℃,（二）浸蠟的步驟,（三）浸蠟注意事項(xiàng) 1．浸蠟最佳溫度應(yīng)是石蠟剛?cè)刍?、或蠟杯底?尚殘留小部分未熔完蠟時(shí)的溫度 2．浸蠟中一般采用浸蠟籃浸蠟法，把組織塊和 標(biāo)簽一齊裝入分格籃內(nèi)浸蠟 3．石蠟應(yīng)在加熱的條件下過(guò)濾除去雜質(zhì) 4．浸蠟用的石蠟要定期更換

28、 5．新石蠟應(yīng)在使用前放在溫箱內(nèi)熔化一次，使 其中的揮發(fā)性物質(zhì)蒸發(fā) 6．包埋結(jié)束后應(yīng)將熔蠟從溫箱內(nèi)取出，以免 石蠟無(wú)益地加溫熔化,六、包埋（石蠟包埋法）,（一）包埋目的及包埋劑 包埋是將某些特殊的支持物質(zhì)浸入到組織塊內(nèi)部，利用支持物質(zhì)的物理特性，將整個(gè)組織加以包埋，最后凝固成均勻一致的較硬固態(tài)結(jié)構(gòu)，以便切片機(jī)制備極薄切片

29、石蠟是組織學(xué)切片技術(shù)中最常用的包埋劑,（二）包埋過(guò)程 1．取預(yù)熱包埋框及金屬板，搭成包埋模具 2. 迅速傾注少量熔蠟于包埋框中 3. 從蠟杯中夾取組織塊，切面向下置于框底 4. 加熔蠟至包埋框上緣 ，將標(biāo)簽紙緊貼旁邊 5. 表面熔蠟?zāi)Y(jié)至一定厚度時(shí)，慢慢浸入冷水 中（夏天用冰水）急速凝固

30、 6. 凝結(jié)蠟塊自動(dòng)漂浮于水面，或30分鐘后推開(kāi) 包埋框，取出蠟塊。 7. 修塊,（三）包埋注意事項(xiàng) 1．包埋蠟的熔點(diǎn)選擇 2．石蠟脆性大時(shí)，可加蜂蠟提高韌性 3．包埋用石蠟和最后浸蠟的石蠟熔點(diǎn)要 相同 4．包埋中組織塊間要有一定距離 5

31、．石蠟?zāi)桃焖?七、切片,（一）石蠟切片機(jī)及切片刀 1．石蠟切片機(jī) 最常用的石蠟切片機(jī)是輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)，它的切片刀固定不動(dòng)，而靠右側(cè)旋轉(zhuǎn)的重輪帶動(dòng)螺紋軸和齒輪，將組織塊夾具按所調(diào)節(jié)的切片厚度向前推進(jìn)，并在上下平面運(yùn)動(dòng)，讓組織塊經(jīng)過(guò)前下方切片刀而切成一定厚度的切片,2．切片刀與磨刀 石蠟切片常用的切片刀為平楔型切片刀，也有一次性切片刀 非一次性使用的切片刀在切片前需要研磨，以

32、保持其鋒利；研磨刀可分為手工研磨刀和機(jī)械研磨刀（磨刀機(jī)）兩種,（二）石蠟切片過(guò)程 1．修塊 2．蠟塊和切片刀固定 3．調(diào)整蠟塊切面和切片刀角度(10°以內(nèi)) 4. 調(diào)整刀臺(tái)與標(biāo)本臺(tái)距離 5. 修整蠟塊切面，暴露完整組織切面 6. 調(diào)整切片厚度調(diào)節(jié)器(厚度為6~8μm) 7. 正式切片

33、8．切片展平 9．貼片和烘片,（1）切片碎卷狀：脫水、透明或浸蠟時(shí)間長(zhǎng)、浸蠟溫度高 （2）蠟片卷曲：刀口不鋒利或臟、刀角傾斜過(guò)度、石蠟過(guò)硬 （3）切片不成蠟帶：室溫低、石蠟過(guò)硬、蠟塊上下邊過(guò)小或 不平 （4）蠟帶彎曲：蠟塊的兩側(cè)大小不等、刀口不鋒利 （5）切片皺褶：石蠟過(guò)軟、浸蠟不完全、刀的傾斜角度過(guò)小 （6）切片厚薄不均：刀口不鋒利、切片機(jī)性能不佳、刀架或

34、 刀或蠟塊未固定牢 （7）切片出現(xiàn)縱紋：刀刃有缺口、石蠟或組織的硬度不一 （8）切片出現(xiàn)橫紋：蠟塊、刀或刀架未固定好 （9）切片粘刀：刀鋒沾污、刀的傾斜角度過(guò)小、刀口不鋒利 （10）蠟塊底邊呈白色：刀的傾斜角度過(guò)小 （11）切片粘蠟塊：刀純、刀口不潔、室內(nèi)溫度高、太干燥,（三）切片過(guò)程中常遇問(wèn)題及可能造成原因,第三節(jié) 蘇木素-伊紅染色方法,染色是將組織浸入染料配制的染色液中，使組織中的不同結(jié)構(gòu)染上不同顏色或

35、不同深淺的顏色，從而產(chǎn)生不同的折射率，便于在光鏡下清楚地顯示組織內(nèi)部各種構(gòu)造,染料是一類有色的以苯環(huán)為基礎(chǔ)的有機(jī)化合物，它不同于一般顏料，因?yàn)樗坏蓄伾?，更重要的是它?duì)組織的不同成份具有不同的親和力。構(gòu)成染料至少必須有兩種原子團(tuán)連接于苯環(huán)上，即能使染料顯色的原子團(tuán)-發(fā)色團(tuán)和能使染料對(duì)不同組織具有不同親和力及加深顏色的原子團(tuán)（酸、堿性基團(tuán)）-助色團(tuán),分類 細(xì)胞核染料有天然染料蘇木素、胭脂紅及人工合成的染料結(jié)晶紫、

36、甲苯胺藍(lán)、甲基綠、美藍(lán)、焦油紫等 細(xì)胞質(zhì)染料有人工合成的伊紅Y、酸性復(fù)紅、苦味酸、水溶性苯胺藍(lán)等,媒染劑為有些二價(jià)或三價(jià)金屬物質(zhì)，如鋁、鐵、銅、鎢等可作為中介媒體物質(zhì)，使原來(lái)幾乎不與組織結(jié)合或結(jié)合能力很弱的部分染料（尤其是天然染料）著色；它主要是通過(guò)增加染料對(duì)組織中某一成份的親和能力，自身又與染料或組織發(fā)生結(jié)合而發(fā)揮作用,助染劑（促染劑）與媒染劑不同，它只加強(qiáng)染 料的染色能力，而自身不

37、參與染色反應(yīng) 分化劑（脫色劑、分色劑）用于退行性染色 法中脫去組織過(guò)染的染料，降低著色顏色 酸性分化劑 0.5~1%的鹽酸酒精（95%以 下）或較稀的冰醋酸水溶液 氧化分化劑 苦味酸、鉻酸、重鉻酸鉀、 過(guò)錳酸鉀等

38、 媒染分化劑 既能促使組織和染料結(jié)合， 又可使已經(jīng)結(jié)合到組織上的染料脫離,一、蘇木素-伊紅染色的基本原理,蘇木素和伊紅染色是組織學(xué)中常規(guī)制片中最基本，也是應(yīng)用最廣泛的染色方法，故稱常規(guī)染色（簡(jiǎn)稱HE染色）,蘇木素（或蘇木精）是一種天然的染料，易溶于酒精而微溶于水，是較好的細(xì)胞核堿性染料，并可將細(xì)胞中不同的結(jié)構(gòu)分化出各種不同的顏色；蘇木素分子須經(jīng)氧化形成蘇木紅分子，才具有真正的染色能力；同

39、時(shí)須配合適當(dāng)?shù)拿饺緞┮栽鰪?qiáng)它對(duì)組織的親和力，達(dá)到染色目的 伊紅（或曙紅）是人工合成的煤焦油類染料，紅色粉末狀，易溶于水或酒精，為酸性細(xì)胞胞質(zhì)染料；有伊紅Y、B、BN等，常用的是伊紅Y。伊紅常作為蘇木素的對(duì)比染色染料，染色中常需加助染劑和分化劑，使染色效果更加好,二、蘇木素-伊紅染液的配制,（一）蘇木素染液 一種是將氧化劑（如氧化汞、高錳酸鉀、過(guò)氧化氫或碘酸鈉等）與媒染劑（硫酸鋁銨、硫酸鋁鉀或硫酸鋁鐵等）直

40、接混合于蘇木素中配成溶液 另一種是先用媒染劑媒染組織結(jié)構(gòu)，再用氧化的蘇木素（自然氧化）染色，最后用媒染劑分色,Harris蘇木素染液 蘇木素 1g 無(wú)水酒精 10ml 硫酸鋁鉀（或硫酸鋁銨） 20g 蒸餾

41、水 200ml 氧化汞 0.5g,Mayer蘇木素液 蘇木素 1g 蒸餾水 1000ml

42、 碘酸鈉 0.2g 硫酸鋁鉀 50g 枸櫞酸鈉 1g 水合氯醛 50g,醇溶性伊紅染液

43、 伊紅Y 0.5g 95%酒精 100ml 水溶性伊紅染液 伊紅Y 0.5-1g 蒸餾水

44、 75ml 95%酒精 25ml 冰醋酸 1~2滴,（二）伊紅染液,（三）分化液,去除過(guò)度染色或不需要著色的組織成份上顏色的過(guò)程，叫分色　　　所使用的試劑配制的液體稱為分化液　　　而蘇木素的分化過(guò)程中，使酸性條件轉(zhuǎn)變成堿性

45、條件，蘇木素染色的結(jié)構(gòu)也由紅色轉(zhuǎn)變成藍(lán)色，所以這一過(guò)程又稱藍(lán)化,1．氫氧化銨水溶液（pH 7.5-8.0 ） 氫氧化銨（氨水） 3ml 蒸餾水 1000ml 2．1%鹽酸酒精溶液 鹽酸

46、 1ml 70%酒精 99ml,三、石蠟切片染色中脫蠟、水洗、 脫水和透明等的作用,石蠟 去石蠟 去二甲苯 水化 顏色 二甲苯 酒精 水 染液 透明 脫水

47、 水分 二甲苯 酒精,,,,,,,,四、染色程序,（一）脫蠟至水 石蠟切片 冰凍切片 1．二甲苯（Ⅰ） 5分鐘 2．二甲苯（Ⅱ） 5分鐘 3．

48、無(wú)水酒精（Ⅰ） 5分鐘 4．無(wú)水酒精（Ⅱ） 5分鐘 5．95%酒精 5分鐘 6．80%酒精 1分鐘 7．70%酒精

49、 1分鐘 8．自來(lái)水 2分鐘 3分鐘 9．蒸餾水 1分鐘 1分鐘,（二）染色

50、 石蠟切片 冰凍切片 1．蘇木素液 5-15分鐘 1-2分鐘 2．自來(lái)水洗 1分鐘 30秒 3．酸性分化液（鏡下控制） 30秒 20秒

51、 4．自來(lái)水藍(lán)化 20分鐘 20秒 5．稀氨水 30秒 6. 蒸餾水 10秒

52、 20秒 7．70%酒精 3分鐘 3分鐘 8．80%酒精 3分鐘 3分鐘 9．沉淀酸化伊紅乙醇液 30秒 30秒,（三）脫水、透明和封片

53、 石蠟切片 冰凍切片 1．95%酒精（Ⅰ） 1分鐘 1分鐘 2．95%酒精（Ⅱ） 1分鐘 1分鐘 3．無(wú)水酒精（Ⅰ）

54、 5分鐘 3分鐘 4．無(wú)水酒精（Ⅱ） 5分鐘 3分鐘 5．無(wú)水酒精（Ⅲ） 5分鐘 3分鐘 6．無(wú)水酒精+二甲苯（1:1） 5分鐘 3分鐘 7．二甲苯（Ⅰ）

55、 5分鐘 3分鐘 8．二甲苯（Ⅱ） 5分鐘 3分鐘 9．二甲苯（Ⅲ） 5分鐘 3分鐘 10．中性樹(shù)膠封片,五、染色注意事項(xiàng),1．染色前需烘烤切片，并立即進(jìn)行染色 2．切片脫蠟后，應(yīng)保持切

56、片在液體中，防止干燥。脫蠟溫度應(yīng)在25℃左右環(huán)境中進(jìn)行，時(shí)間可適當(dāng)延長(zhǎng) 3．獲得好的染色效果，需選擇合適的固定液和固定時(shí)間 4．染色時(shí)間應(yīng)根據(jù)染液的種類、新舊、組織種類、固定液種類及環(huán)境溫度等而定 5．蘇木精染色后，分色和藍(lán)化應(yīng)在顯微鏡下進(jìn)行，以細(xì)胞核染色清晰，而胞質(zhì)等基本無(wú)色為佳,6．伊紅水溶液染色的切片，易被低濃度酒精脫水時(shí)洗掉。最好在脫水至95%酒精時(shí)，進(jìn)行伊紅乙醇液染色，然后脫水透明