解剖小白鼠實驗

1、細(xì)胞原代培養(yǎng)(Cell primary culture),實驗?zāi)康?了解細(xì)胞體外培養(yǎng)的原理、基本方 法，了解無菌操作方法及注意事項。 學(xué)習(xí)觀察體外培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)及生長 狀況。,實驗原理,用直接從機體獲得的細(xì)胞進(jìn)行的培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。這種培養(yǎng)過程主要是采用無菌操作的方法，把組織（或器官）從動物體內(nèi)取出，經(jīng)酶消化處理，使分散成單個細(xì)胞，然后在人工條件下培養(yǎng)，使其不斷地生長和繁殖。原代培養(yǎng)是建立各種細(xì)胞系的第一步。,消化培養(yǎng)法,又

2、稱為組織消化分散法：將妨礙細(xì)胞生長的細(xì)胞間質(zhì)去除，使細(xì)胞分散，形成懸液，按不同濃度接種培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。,實驗儀器,超凈工作臺，壓力蒸汽消毒器，電熱干燥箱，濾器，酸缸CO2培養(yǎng)箱倒置顯微鏡自動雙重純水蒸餾器，純水儀耗材：培養(yǎng)瓶，吸管，電動吸引器,超凈臺,超凈工作臺的工作原理是利用鼓風(fēng)機驅(qū)動空氣遁過高效濾器，除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺面，使工作臺內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。,濾 器,濾器工作原理,CO2培養(yǎng)箱,C

3、O2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37 ℃ ，5％CO2 。使用CO2培養(yǎng)箱應(yīng)注意的問題：①用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時，需將瓶蓋微松，以保證通氣。②保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒（90℃ ，14 h)。③箱內(nèi)無菌蒸餾水3000毫升蒸餾水槽中以保持箱內(nèi)濕度，避兔培養(yǎng)液蒸發(fā)。,倒置顯微鏡,自動雙重純水蒸餾器 純水儀,培 養(yǎng) 板,培養(yǎng)瓶,實驗材料,2月齡的小鼠,實驗試劑,（1） 1640-RPMI培養(yǎng)液（2）  小牛血清（3）&#

4、160; 青、鏈霉素（4） PBS液（5）  5％NaHCO3（6）  75％酒精,實驗步驟,一、培養(yǎng)前的準(zhǔn)備工作 （1）  清洗與消毒（2）  配制溶液（3）  紫外線消毒（4） 洗手和著裝（5） 進(jìn)入無菌室,實驗步驟,動物細(xì)胞原代培養(yǎng)過程圖,方法與步驟,（1）動物拉椎處死（2）取肝及剪碎：剖開腹部，將肝臟取出，放入小培養(yǎng)皿中，用PBS液洗滌1次；將肝剪成1mm大

5、小的塊，再用PBS液洗滌2次，直到液體澄清。,（3）消化及分散組織塊：將上述清洗過的組織放入試管內(nèi)，加入的0.25％胰蛋白酶液，完全沒過組織，置37℃水浴中消化20 ～ 30min，每隔10min搖動一次，直到組織塊變得疏松，粘稠，且顏色略變?yōu)榘咨珵橹?。取出試管，吸去胰蛋白酶液，加?ml培養(yǎng)液，用吸管反復(fù)吹打組織塊，使其分散成細(xì)胞懸液，取上清液至另一試管中。,（4）觀察與計數(shù)：從細(xì)胞懸液中取出1滴滴于載玻片上，顯微鏡下觀察細(xì)胞的數(shù)目。

6、看到球型的細(xì)胞，證明消化下來細(xì)胞，實驗成功。,作業(yè):,1.在細(xì)胞培養(yǎng)過程中如何防止污染?,無菌操作的幾個注意事項,1、操作前要洗手，進(jìn)入超凈臺后手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試。 2、點燃酒精燈，操作在火焰附近進(jìn)行，耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼，金屬器械燒灼時間不能太長，以免退火，并冷卻后才能夾取組織，吸取過營養(yǎng)液的用具不能再燒灼，以免燒焦形成碳膜。 3、操作動作要準(zhǔn)確敏捷，但又不能太快，以防空氣