高通量篩選環(huán)境雌激素類化合物的方法學(xué)研究.pdf

1、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物是指由于人類的生產(chǎn)和生活活動(dòng)釋放到環(huán)境中的、對(duì)人體內(nèi)和動(dòng)物體內(nèi)內(nèi)源性的正常激素功能施加影響，從而影響機(jī)體內(nèi)分泌系統(tǒng)化學(xué)物質(zhì)作用的物質(zhì)，這類物質(zhì)通稱為“外源性干擾內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)”。環(huán)境雌激素是環(huán)境內(nèi)分泌干擾物中最大的一類，也是研究最多，最受重視的一類。目前，檢測(cè)環(huán)境雌激素的方法主要有化學(xué)法和生物法?；瘜W(xué)法檢測(cè)環(huán)境雌激素靈敏度高、特異度好，定性和定量準(zhǔn)確。但是用儀器檢測(cè)環(huán)境雌激素，只能對(duì)已知的環(huán)境雌激素進(jìn)行檢測(cè)，而且，在檢

2、測(cè)前一般還要對(duì)樣品要進(jìn)行提取、凈化、濃縮等前期處理。由于這些化學(xué)方法使用的儀器昂貴、檢測(cè)成本高、分析過程冗長(zhǎng)、技術(shù)復(fù)雜、對(duì)檢測(cè)人員專業(yè)化程度要求高，不適合大量樣本的環(huán)境雌激素常規(guī)檢測(cè)。建立在生物學(xué)基礎(chǔ)上檢測(cè)環(huán)境雌激素的方法大多需要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件要求較高、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不同的實(shí)驗(yàn)室使用的細(xì)胞不同，不便于結(jié)果的相互比較，培養(yǎng)細(xì)胞所用的血清也要經(jīng)過活性炭和葡聚糖處理，去除血清中內(nèi)源性的雌激素后才能使用，否則會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果。有的環(huán)境

3、雌激素還具有細(xì)胞毒性，這樣有可能導(dǎo)致得出錯(cuò)誤的結(jié)論。
　　 因此，根據(jù)大多數(shù)環(huán)境雌激素與機(jī)體作用都是干擾天然雌激素與雌激素受體結(jié)合，我們以雌激素受體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分析為基礎(chǔ)，建立以下三種方法來高通量的篩選環(huán)境雌激素。
　　 第一部分：基于ELISA的受體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合法檢測(cè)環(huán)境雌激素
　　 目的：環(huán)境雌激素是最主要的一類環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，它們進(jìn)入生物體后，可通過干擾生物體自身激素的合成、分泌、轉(zhuǎn)運(yùn)、結(jié)合、活性反應(yīng)、代謝、消解

4、或產(chǎn)生類似生物體自身激素的作用，對(duì)生物有機(jī)體維護(hù)正常的動(dòng)態(tài)平衡、繁殖、生長(zhǎng)及行為產(chǎn)生不利的影響。本研究的目的旨在建立環(huán)境雌激素的體外快速篩選方法。
　　 方法：采用免疫測(cè)定介導(dǎo)受體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)定量檢測(cè)環(huán)境雌激素。將17β-雌二醇-BSA固定在微孔板上，環(huán)境雌激素與微孔板上的17β-雌二醇-BSA競(jìng)爭(zhēng)性的與雌激素受體結(jié)合，與微孔板上17β-雌二醇-BSA結(jié)合的受體與雌激素受體的抗體、雌激素受體抗體的二抗形成一個(gè)三明治形式的復(fù)合物，

5、通過顯色劑顯色，最后用比色法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行定量。
　　 結(jié)果：整個(gè)反應(yīng)中環(huán)境雌激素濃度越高，溶液的吸光度值的變化就越小，環(huán)境雌激素的濃度與吸光度值成負(fù)相關(guān)。定量研究可以得到環(huán)境雌激素劑量－效應(yīng)關(guān)系曲線，在一定濃度范圍內(nèi)（10ng/L～100μg/L），溶液的吸光度值與環(huán)境雌激素的濃度直接呈現(xiàn)良好的線形關(guān)系（R2=0.9583）。利用這種方法能檢測(cè)到的標(biāo)準(zhǔn)品雌二醇的最低濃度為10ng/L。
　　 結(jié)論：本方法檢測(cè)環(huán)境雌激素

6、操作簡(jiǎn)便、無需復(fù)雜昂貴的儀器，具有廣泛的應(yīng)用前景。
　　 第二部分：熒光標(biāo)記17β-雌二醇檢測(cè)環(huán)境雌激素
　　 目的：熒光標(biāo)記這種非放射性標(biāo)記技術(shù)已成為現(xiàn)代分析檢測(cè)中不可或缺的重要方法之一,然而將此技術(shù)應(yīng)用于環(huán)境雌激素的篩選并不廣泛。本研究旨在探索熒光標(biāo)記技術(shù)在環(huán)境雌激素定量檢測(cè)中的應(yīng)用。
　　 方法：首先將雌激素受體的抗體固定于微孔板中，將待測(cè)樣本或17β-雌二醇、與定量的17β-雌二醇-FITC、雌激素受體混

7、和后加入微孔板中，孵育后取上清（上清中含有因環(huán)境雌激素干擾而未能與雌激素受體結(jié)合的的17β-雌二醇-FITC），加入另一新的微孔板中，用酶標(biāo)儀檢測(cè)溶液中熒光信號(hào)的強(qiáng)度。
　　 結(jié)果：溶液的熒光強(qiáng)度與環(huán)境雌激素的濃度呈正相關(guān)，在一定濃度范圍內(nèi)（10ng/L～100μg/L），溶液的熒光強(qiáng)度與環(huán)境雌激素濃度之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（R2=0.9793）。利用這種方法能夠檢測(cè)到的標(biāo)準(zhǔn)品17β-雌二醇的最低濃度為10 ng/L。
　

8、　 結(jié)論：本研究方法檢測(cè)環(huán)境雌激素靈敏度高，無需復(fù)雜昂貴的設(shè)備，試驗(yàn)操作非常簡(jiǎn)單，可在微孔板和芯片上進(jìn)行，是一種高通量快速篩選環(huán)境雌激素的方法。
　　 第三部分：納米金顆粒修飾雌激素受體反應(yīng)原件檢測(cè)痕量環(huán)境雌激素的方法學(xué)研究
　　 目的：雌激素受體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分析試驗(yàn)是重要的環(huán)境雌激素的篩選試驗(yàn)，是美國(guó)EDSTAC首選的第一級(jí)環(huán)境內(nèi)分泌干擾物篩選試驗(yàn)之一。本研究根據(jù)環(huán)境雌激素在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮作用的基本機(jī)理，即環(huán)境雌激素進(jìn)入機(jī)體

9、，結(jié)合并激活雌激素受體，進(jìn)而使受雌激素受體控制的基因表達(dá)。本研究是利用納米金標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)介導(dǎo)雌激素受體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分析建立的一種環(huán)境雌激素高通量快速篩選方法。
　　 方法：首先將17β-雌二醇-BSA固定于微孔板中，將待測(cè)樣本與定量的雌激素受體混和后加入微孔板中，孵育后取上清（上清中含有因環(huán)境雌激素干擾而未能與微孔板上的17β-雌二醇結(jié)合的雌激素受體），將上清加入另一包被有雌激素受體抗體的的微孔板中，使雌激素受體與抗體結(jié)合，然后加入

10、標(biāo)記有納米金的雌激素反應(yīng)元件探針，孵育一段時(shí)間，用銀染增強(qiáng)顯色檢測(cè)光密度。
　　 結(jié)果：在一定的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，溶液的吸光度值與環(huán)境雌激素的量呈正相關(guān)，定量研究可以得到在一定反應(yīng)時(shí)間點(diǎn)（銀染增強(qiáng)時(shí)間100～140秒）和一定濃度范圍內(nèi)（100pg/L～1μg/L），溶液的吸光度值與17β-雌二醇之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（R2=0.9764）。利用這種方法能夠檢測(cè)到的標(biāo)準(zhǔn)品17β-雌二醇的最低濃度為100 pg/L。
　　 結(jié)論：