單顆粒暗場光散射成像：靈敏度、準確度提升及多靶物分析應用研究.pdf

1、獨特的斜射照明方式使暗場光散射成像具有無背景信號、信噪比高及分辨率高等獨特優(yōu)勢。貴金屬納米顆粒作為等離子體探針具有光學信號強、光穩(wěn)定性高、光學性質可調及易標記等優(yōu)勢。將單個貴金屬納米顆粒作為光學探針，與暗場光散射成像技術結合后獲得單顆粒暗場光散射成像技術。單顆粒暗場光散射成像技術具有傳統(tǒng)成像技術無法比擬的優(yōu)勢，如高靈敏度、高分辨率及精準的局域信息，因此，在單納米顆粒水平監(jiān)控動態(tài)反應過程和空間分辨方面具有廣闊的應用前景。然而，單顆粒暗場光

2、散射成像技術仍存在一定局限性，例如對單納米顆粒局域表面等離子體共振性質研究不完善、暗場成像結果準確度不高及無法實現(xiàn)定量分析多靶物等。
　　本論文圍繞上述研究難點和問題，在單顆粒暗場光散射成像技術的成像性能改進及多靶物分析檢測應用方面開展了如下具體工作：
　　1.徑向比對單個金納米棒光散射分析靈敏度的影響
　　首先，我們制備出具有不同形貌的金納米顆粒（AuNPs），利用暗場光學顯微鏡與掃描電子顯微鏡對同一批次納米顆粒進行

3、共定位，研究形貌與其散射光性質的關系。結果顯示，在暗場顯微鏡下散射綠光的為球形或者立方納米顆粒，散射黃光的為橢球形顆粒，散射紅光的為棒狀納米顆粒，并且徑向比越大的納米顆粒其散射光的紅色程度越大。接下來，我們將納米顆粒置于具有不同折光指數的介質中觀察其散射光的變化，發(fā)現(xiàn)徑向比越大的金納米棒（AuNRs）對折光指數的變化響應越靈敏。該研究為進一步篩選具有高靈敏度的探針顆粒提供了理論基礎。
　　2.內標納米顆粒提高暗場光學成像的準確度<

4、br>　　手工操作會在暗場光學成像結果中引入一些不可避免的誤差。為了校準這一部分誤差，我們引入內標納米顆粒（IR），利用IR的散射光信號來校準探針納米顆粒的散射光信號。我們選用未經修飾的AuNPs作為IR，選擇銀納米顆粒（AgNPs）或者修飾后的AuNPs作為探針納米顆粒。首先，我們考察了這種內標法的使用是否可行。結果表明，在不發(fā)生化學反應或者經受外界物理刺激的情況下，IR與探針納米顆粒散射光強度的比值保持不變，證明這種方法是可行的。接

5、下來，我們做了三組實驗考察引入IR對暗場下探針光學信號準確度的影響：（1）室溫下監(jiān)控AgNPs在空氣中的氧化過程；（2）利用AuNPs催化葡萄糖產生的過氧化氫（H2O2）降低AgNPs散射光強度來測定葡萄糖的濃度；（3）研究AuNPs與染料四甲基羅丹明（TAMRA）或者Cy3發(fā)生等離子體共振能量轉移（PRET）后散射光的變化。結果表明，未經修飾的AuNPs作為IR可以大大提升探針納米顆粒暗場光散射成像結果的準確度。
　　3.金納米

6、顆粒與染料發(fā)生等離子體共振能量轉移效率與供受體之間距離的關系
　　我們將內標法進一步引入到對PRET的理論研究中。粒徑為50nm的AuNPs的散射峰位于550nm左右，而染料TAMRA和Cy3在550nm左右具有強吸收。當納米顆粒與染料之間距離足夠近時，兩者之間能夠發(fā)生PRET。其中，AuNPs作為供體，染料作為受體。我們將納米顆粒與染料利用雙鏈DNA連接在一起，通過調節(jié)雙鏈DNA的長度來調控供受體之間的距離，并考察不同距離下Au

7、NPs散射光變化情況，這樣就能得到供受體之間的距離對PRET效率的影響。時域有限差分方法（FDTD）模擬結果和實驗結果均表明，供受體之間的距離確實會影響PRET效率，兩者之間距離越近，則PRET效率越高。
　　4.雙色光學探針對兩種疾病標志物的同時檢測
　　我們在載玻片表面修飾甲胎蛋白（AFP）抗體和癌胚抗原（CEA）抗體。加入AFP和CEA后，修飾有AFP抗體的AuNPs和修飾有CEA抗體的AgNPs通過形成三明治免疫夾心

8、結構而結合到玻片表面。金納米顆和銀納米顆在暗場下分別散射綠光和藍光，通過計數暗場光散射成像圖片中綠色光斑和藍色光斑的數量就能實現(xiàn)同時檢測AFP和CEA，檢測范圍為0.5-100ng/mL。我們進一步考察了AFP和CEA在同時檢測中的相互干擾，發(fā)現(xiàn)當兩者濃度在0.5-10ng/mL時不存在相互干擾。并且我們構建的這種方法能夠用于多靶物檢測，只要使用散射多種顏色的納米光學探針，便能實現(xiàn)對多種靶物的同時靈敏檢測。
　　總之，本論文對單顆