單顆粒暗場(chǎng)光散射成像：靈敏度、準(zhǔn)確度提升及多靶物分析應(yīng)用研究.pdf

1、獨(dú)特的斜射照明方式使暗場(chǎng)光散射成像具有無(wú)背景信號(hào)、信噪比高及分辨率高等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。貴金屬納米顆粒作為等離子體探針具有光學(xué)信號(hào)強(qiáng)、光穩(wěn)定性高、光學(xué)性質(zhì)可調(diào)及易標(biāo)記等優(yōu)勢(shì)。將單個(gè)貴金屬納米顆粒作為光學(xué)探針，與暗場(chǎng)光散射成像技術(shù)結(jié)合后獲得單顆粒暗場(chǎng)光散射成像技術(shù)。單顆粒暗場(chǎng)光散射成像技術(shù)具有傳統(tǒng)成像技術(shù)無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)，如高靈敏度、高分辨率及精準(zhǔn)的局域信息，因此，在單納米顆粒水平監(jiān)控動(dòng)態(tài)反應(yīng)過(guò)程和空間分辨方面具有廣闊的應(yīng)用前景。然而，單顆粒暗場(chǎng)光

2、散射成像技術(shù)仍存在一定局限性，例如對(duì)單納米顆粒局域表面等離子體共振性質(zhì)研究不完善、暗場(chǎng)成像結(jié)果準(zhǔn)確度不高及無(wú)法實(shí)現(xiàn)定量分析多靶物等。
　　本論文圍繞上述研究難點(diǎn)和問(wèn)題，在單顆粒暗場(chǎng)光散射成像技術(shù)的成像性能改進(jìn)及多靶物分析檢測(cè)應(yīng)用方面開(kāi)展了如下具體工作：
　　1.徑向比對(duì)單個(gè)金納米棒光散射分析靈敏度的影響
　　首先，我們制備出具有不同形貌的金納米顆粒（AuNPs），利用暗場(chǎng)光學(xué)顯微鏡與掃描電子顯微鏡對(duì)同一批次納米顆粒進(jìn)行

3、共定位，研究形貌與其散射光性質(zhì)的關(guān)系。結(jié)果顯示，在暗場(chǎng)顯微鏡下散射綠光的為球形或者立方納米顆粒，散射黃光的為橢球形顆粒，散射紅光的為棒狀納米顆粒，并且徑向比越大的納米顆粒其散射光的紅色程度越大。接下來(lái)，我們將納米顆粒置于具有不同折光指數(shù)的介質(zhì)中觀察其散射光的變化，發(fā)現(xiàn)徑向比越大的金納米棒（AuNRs）對(duì)折光指數(shù)的變化響應(yīng)越靈敏。該研究為進(jìn)一步篩選具有高靈敏度的探針顆粒提供了理論基礎(chǔ)。
　　2.內(nèi)標(biāo)納米顆粒提高暗場(chǎng)光學(xué)成像的準(zhǔn)確度<

4、br>　　手工操作會(huì)在暗場(chǎng)光學(xué)成像結(jié)果中引入一些不可避免的誤差。為了校準(zhǔn)這一部分誤差，我們引入內(nèi)標(biāo)納米顆粒（IR），利用IR的散射光信號(hào)來(lái)校準(zhǔn)探針納米顆粒的散射光信號(hào)。我們選用未經(jīng)修飾的AuNPs作為IR，選擇銀納米顆粒（AgNPs）或者修飾后的AuNPs作為探針納米顆粒。首先，我們考察了這種內(nèi)標(biāo)法的使用是否可行。結(jié)果表明，在不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)或者經(jīng)受外界物理刺激的情況下，IR與探針納米顆粒散射光強(qiáng)度的比值保持不變，證明這種方法是可行的。接

5、下來(lái)，我們做了三組實(shí)驗(yàn)考察引入IR對(duì)暗場(chǎng)下探針光學(xué)信號(hào)準(zhǔn)確度的影響：（1）室溫下監(jiān)控AgNPs在空氣中的氧化過(guò)程；（2）利用AuNPs催化葡萄糖產(chǎn)生的過(guò)氧化氫（H2O2）降低AgNPs散射光強(qiáng)度來(lái)測(cè)定葡萄糖的濃度；（3）研究AuNPs與染料四甲基羅丹明（TAMRA）或者Cy3發(fā)生等離子體共振能量轉(zhuǎn)移（PRET）后散射光的變化。結(jié)果表明，未經(jīng)修飾的AuNPs作為IR可以大大提升探針納米顆粒暗場(chǎng)光散射成像結(jié)果的準(zhǔn)確度。
　　3.金納米

6、顆粒與染料發(fā)生等離子體共振能量轉(zhuǎn)移效率與供受體之間距離的關(guān)系
　　我們將內(nèi)標(biāo)法進(jìn)一步引入到對(duì)PRET的理論研究中。粒徑為50nm的AuNPs的散射峰位于550nm左右，而染料TAMRA和Cy3在550nm左右具有強(qiáng)吸收。當(dāng)納米顆粒與染料之間距離足夠近時(shí)，兩者之間能夠發(fā)生PRET。其中，AuNPs作為供體，染料作為受體。我們將納米顆粒與染料利用雙鏈DNA連接在一起，通過(guò)調(diào)節(jié)雙鏈DNA的長(zhǎng)度來(lái)調(diào)控供受體之間的距離，并考察不同距離下Au

7、NPs散射光變化情況，這樣就能得到供受體之間的距離對(duì)PRET效率的影響。時(shí)域有限差分方法（FDTD）模擬結(jié)果和實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，供受體之間的距離確實(shí)會(huì)影響PRET效率，兩者之間距離越近，則PRET效率越高。
　　4.雙色光學(xué)探針對(duì)兩種疾病標(biāo)志物的同時(shí)檢測(cè)
　　我們?cè)谳d玻片表面修飾甲胎蛋白（AFP）抗體和癌胚抗原（CEA）抗體。加入AFP和CEA后，修飾有AFP抗體的AuNPs和修飾有CEA抗體的AgNPs通過(guò)形成三明治免疫夾心

8、結(jié)構(gòu)而結(jié)合到玻片表面。金納米顆和銀納米顆在暗場(chǎng)下分別散射綠光和藍(lán)光，通過(guò)計(jì)數(shù)暗場(chǎng)光散射成像圖片中綠色光斑和藍(lán)色光斑的數(shù)量就能實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)AFP和CEA，檢測(cè)范圍為0.5-100ng/mL。我們進(jìn)一步考察了AFP和CEA在同時(shí)檢測(cè)中的相互干擾，發(fā)現(xiàn)當(dāng)兩者濃度在0.5-10ng/mL時(shí)不存在相互干擾。并且我們構(gòu)建的這種方法能夠用于多靶物檢測(cè)，只要使用散射多種顏色的納米光學(xué)探針，便能實(shí)現(xiàn)對(duì)多種靶物的同時(shí)靈敏檢測(cè)。
　　總之，本論文對(duì)單顆