鄉(xiāng)鎮(zhèn)檢驗(yàn)人員培訓(xùn)免疫

1、1,第一章 免疫學(xué)基礎(chǔ)知識(shí),南充中心醫(yī)院免疫室 李欣,,2010. 4. 3,2,一、免疫（Immune）的定義,免疫的最初概念：免除瘟疫免疫的傳統(tǒng)概念：抗感染免疫現(xiàn)代免疫的概念：是機(jī)體識(shí)別“自身”與“非己”抗原，對(duì)“非己”抗原產(chǎn)生排斥作用，對(duì)自身抗原形成天然耐受的一種生理功能。,第一節(jié) 免疫的基本概念,3,正常情況下，這種生理功能對(duì)機(jī)體有益，可產(chǎn)生抗感染、抗腫瘤和維持機(jī)體生理平衡及穩(wěn)定的保護(hù)作用。 當(dāng)免疫功能失調(diào)

2、時(shí)，在一定條件下，也會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不利的影響，如：超敏反應(yīng)、自身免疫病和腫瘤等。,4,二、免 疫 的 功 能,免疫功能是免疫系統(tǒng)在識(shí)別和清除“非己”抗原的過(guò)程中所產(chǎn)生的各種生物學(xué)作用的總稱。主要包括： 1.免疫防御（Immunologic defence)： 是機(jī)體針對(duì)外來(lái)病原體的抗感染功能。正常時(shí)可防御病原體的感染；防御功能過(guò)強(qiáng)可產(chǎn)生超敏反應(yīng)，過(guò)弱則表現(xiàn)為免疫缺陷。,5,2.免疫自穩(wěn)(immunologic homeos

3、tasis)： 免疫系統(tǒng)維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定的生理機(jī)能。 正常：可及時(shí)清除體內(nèi)損傷、衰老、變性的細(xì)胞和抗原－抗體復(fù)合物，而對(duì)自身成份保持免疫耐受； 異常：可發(fā)生生理功能紊亂、自身免疫病等。,6,3.免疫監(jiān)視(immunologic surveillance)： 是機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別、清除體內(nèi)突變、畸變細(xì)胞以及被病毒感染細(xì)胞的生理性保護(hù)作用。 喪失：機(jī)體突變細(xì)胞失控，可能導(dǎo)致腫瘤發(fā)生或出現(xiàn)病毒的持續(xù)感染

4、。,7,,,8,,三、免疫的類型及其特征,一、固有免疫：概念：出生時(shí)即有的天然免疫，經(jīng)遺傳獲得，非特 異性，也稱非特異性/先天性免疫。組成：屏障結(jié)構(gòu)、吞噬細(xì)胞、某些體液因子。二、適應(yīng)性免疫：概念：出生后接觸特定抗原獲得的針對(duì)該物質(zhì) 的免疫，也稱獲得性/特異性免疫。包括 體液免疫、細(xì)胞免疫。,9,,第二節(jié) 抗原基礎(chǔ)知識(shí) 一、抗原概念（antigen，Ag） 是能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性

5、免疫應(yīng)答、并能與相應(yīng)的應(yīng)答產(chǎn)物（抗體和/或效應(yīng)淋巴細(xì)胞）在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)。,10,二、抗原的特性 1 免疫原性： 抗原能刺激特異性免疫細(xì)胞，使之活化、增生、分化，最終產(chǎn)生抗體和效應(yīng)淋巴細(xì)胞的特性。2 免疫反應(yīng)性: 抗原可在體內(nèi)、外與 相應(yīng)的抗體/效應(yīng)淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合，產(chǎn)生免疫反應(yīng)的特性。,11,三、完全抗原、半抗原、載體1、完全抗原 （complete antigen): 既有免疫原性又有抗原性的物

6、質(zhì)，如多數(shù)蛋白質(zhì)分子。2、半抗原（Hapten):又稱不完全抗原，單獨(dú)存在時(shí)只具有免疫反應(yīng)性而無(wú)免疫原性的物質(zhì)，如二硝基酚、青霉素。,12,3、載體 與半抗原結(jié)合后使其具有免疫原性的物質(zhì)，即半抗原+載體=完全抗原。 四、 耐受原與變應(yīng)原 1 耐受原 (tolerogen):引起機(jī)體產(chǎn)生免疫耐受的抗原。 2 變應(yīng)原 (allergen): 引起機(jī)體產(chǎn)生變態(tài)反應(yīng)的抗原。,13,五、 抗原的特異性與交叉反應(yīng),免疫原

7、性的特異性：某種抗原只能刺激機(jī)體產(chǎn)生某種特定的應(yīng)答產(chǎn)物。如：傷寒桿菌免疫動(dòng)物產(chǎn)生抗傷寒桿菌抗體 抗原性的特異性：抗原只能與其相應(yīng)的抗體或致敏淋巴細(xì)胞結(jié)合。如：傷寒桿菌只能與抗傷寒桿菌抗體結(jié)合,14,,1 、 表位與抗原決定簇 抗原決定簇（antigenic determinant,AD）: 又稱表位（epitope），指抗原分子中決定 抗原特異性的特殊的化學(xué)基團(tuán)，是抗原分子與抗體及T

8、CR/BCR受體特異結(jié)合的部位，也是被免疫細(xì)胞識(shí)別的標(biāo)志及免疫反應(yīng)具有特異性的物質(zhì)基礎(chǔ)。 表位的性質(zhì)、數(shù)目和空間構(gòu)象決定了抗原 的特異性。,15,,2、抗原抗體反應(yīng)的特異性 抗原的特異性是相對(duì)的，因?yàn)樘烊坏目乖肿颖砻婵纱嬖谥喾N表位，不同的抗原分子表面存在相同或相似的表位，可引起交叉反應(yīng)。3、抗原結(jié)合價(jià)： 能和相應(yīng)抗體結(jié)合的功能性表位的數(shù)目 半抗原→ 單價(jià) 天然抗原→ 多價(jià)

9、多價(jià)抗原可同時(shí)與多種/多個(gè)抗體結(jié)合,16,4、 共同抗原和交叉反應(yīng) （1）共同抗原：兩種或兩種以上抗原具有的相同或相似的表位。,,,,,,,表位1,表位2,表位3,表位1,,A抗原,B抗原,17,,,（2）交叉反應(yīng)：抗體與具有相同或相似的表位的抗原之間出現(xiàn)的反應(yīng)。 血 清(Ab1、Ab2) + AgA 特異性反應(yīng) Ab1+AgB

10、 交叉反應(yīng) 意義 與疾病發(fā)生有關(guān)：如急性腎小球腎炎 用于疾病診斷：如外斐反應(yīng),,,,,表位1,,表位3,表位1,,A抗原,B抗原,表位2,,,18,1、病原微生物及其代謝產(chǎn)物（1）病原微生物 如細(xì)菌、病毒、螺旋體，對(duì)機(jī)體有較強(qiáng)的免疫原性。（2）細(xì)菌的代謝產(chǎn)物 外毒素： 類毒素:外毒素經(jīng)0.3%-0.4%的甲醛處理后,使其失去毒性而保留免疫原性的物質(zhì)。,六、 醫(yī)學(xué)上重要的抗原,19,2、動(dòng)物免

11、疫血清 用類毒素免疫動(dòng)物后，動(dòng)物的血清中可含有大量的抗毒素，即動(dòng)物的免疫血清。這種抗血清對(duì)人體而言既提供特異性抗體，又是異種蛋白。3、異嗜性抗原 又稱Forssman抗原，指一類與種屬無(wú)關(guān)，存在于人、動(dòng)物、植物和微生物之間的共同抗原。如：溶血性鏈球菌/人腎小球基底膜之間的共同抗原。,20,4、同種異型抗原 同一種屬不同個(gè)體之間的不同抗原。如人類的ABO、Rh血型抗原、HLA等。5、自身抗原 隱蔽的自身抗原與

12、自身免疫系統(tǒng)隔絕的組織受到外傷等因素而暴露，如：腦組織、精子外傷暴露。被修飾的自身抗原自身組織在理化、生物等作用下結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，如：變性的IgG。,21,6、腫瘤抗原 腫瘤特異性抗原（Tumor Specific Antigen，TSA）腫瘤相關(guān)抗原（Tumor Associated Antigen，TAA）7、超抗原(super antigen,SAg) 只需極低濃度即可激活5%-20%T細(xì)胞克隆，產(chǎn)生極強(qiáng)的免疫應(yīng)答的抗原。

13、,22,8、其他 有絲分裂原： 植物血凝素、刀豆蛋白A T細(xì)胞 細(xì)菌脂多糖、葡萄球菌A蛋白 B細(xì)胞,,,23,七 佐劑 概念： 一類與抗原一起或預(yù)先注入機(jī)體，能增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型的非特異性免疫增強(qiáng)劑。如：羊毛脂，石蠟油，內(nèi)毒素。常見(jiàn)為福氏佐劑。,24,第三節(jié) 免疫球蛋白,,25,一﹑概 述,Ab：是由抗原刺激B 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞后所產(chǎn)生，并能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合

14、、具有免疫功能的球蛋白，也稱為抗體（antibody,Ab）。,Ig：把具有抗體活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗體相似的球蛋白統(tǒng)稱為免疫球蛋白。,26,,,Ig與Ab的關(guān)系,Ig與Ab的區(qū)別：Ig是化學(xué)結(jié)構(gòu)的概念，Ab 是生物學(xué)功能的概念。所有的Ab都是Ig，但I(xiàn)g并非都有抗體活性。,Ig,Ab,,,27,二、Ig的基本結(jié)構(gòu)1、基本結(jié)構(gòu)：由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈通過(guò)二硫鍵連接而成的四肽鏈結(jié)構(gòu)。,28,抗體的立體模型,29,Ig的基本結(jié)構(gòu),,

15、30,2、免疫球蛋白的功能區(qū),VH和VL：與抗原特異性結(jié)合的部位；CL和CH1：某些同種異型Ig遺傳標(biāo)記；IgG的CH2、IgM的CH3： 補(bǔ)體C1q結(jié)合點(diǎn) 激活補(bǔ)體經(jīng)典途徑；CH3/CH4 結(jié)合不同細(xì)胞表面FcR 不同生物學(xué)效應(yīng)。,,,31,1、IgG血清含量最多；半衰期最長(zhǎng)；出生后3個(gè)月開(kāi)始合成，3-5歲接近成人水平；是唯一能通過(guò)胎盤的Ig，發(fā)揮自然被動(dòng)免疫功能；具有活化補(bǔ)體經(jīng)典途徑的能力

16、（IgG3>IgG1>IgG2）；具有調(diào)理作用、ADCC作用。是主要的抗感染抗體，具有抗菌、中和病毒和中和毒素的作用；,三﹑五類Ig的特性和功能,32,2、IgM,為五聚體，分子量最大，稱為巨球蛋白；個(gè)體發(fā)育中最先出現(xiàn)的Ig，胚胎晚期即能產(chǎn)生，臍帶血IgM增高提示胎內(nèi)感染（如風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒感染等）；抗原刺激機(jī)體時(shí)，是體內(nèi)最先產(chǎn)生的Ig；血清IgM升高說(shuō)明有近期感染；有強(qiáng)大激活補(bǔ)體能力，在機(jī)體免疫防御的早期中具

17、有重要作用。,33,3、IgA,有單體的血清型和分泌型IgA；分泌型IgA是機(jī)體粘膜局部抗感染免疫的重要因素（呼吸道和消化道）；初乳中的sIgA可對(duì)嬰幼兒發(fā)揮自然被動(dòng)免疫作用。 4、IgE屬親細(xì)胞抗體，可與肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞表面FcεR結(jié)合，介導(dǎo)I型超敏反應(yīng)；是血清中含量最低的Ig；主要由呼吸道、胃腸道粘膜固有層的漿細(xì)胞產(chǎn)生。,34,5、IgD,血清中含量低，其生物學(xué)作用尚不清楚；SmIgD可作為B細(xì)

18、胞分化成熟標(biāo)記，成熟B細(xì)胞同時(shí)表達(dá)SmIgM和SmIgD。,35,4﹑免疫球蛋白的生物學(xué)活性,(1)特異性結(jié)合抗原(2)激活補(bǔ)體 (3)通過(guò)與細(xì)胞FcR結(jié)合發(fā)揮生物效應(yīng)：(4)選擇性傳遞 IgG通過(guò)胎盤；sIgA穿過(guò)粘膜的功能(5)具有免疫原性,36,免疫球蛋白的功能,37,第二章 抗原或抗體的檢測(cè),南充中心醫(yī)院免疫室 李欣,38,第一節(jié) 概述,抗原-抗體反應(yīng)包括沉淀反應(yīng)、凝集反應(yīng)、溶解反應(yīng)、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)和

19、中和反應(yīng)等。 抗原-抗體反應(yīng)可用已知的特異性抗體檢測(cè)未知的抗原；也可用已知的抗原檢測(cè)未知的抗體。免疫熒光技術(shù)、免疫酶技術(shù)、同位素標(biāo)記技術(shù)、發(fā)光免疫分析等免疫標(biāo)記技術(shù)提高了抗原抗體反應(yīng)的敏感性。,39,一﹑抗原-抗體反應(yīng)的特點(diǎn),抗原-抗體的結(jié)合是特異性結(jié)合,抗原抗體結(jié)合是分子表面的非共價(jià)鍵結(jié)合,抗原抗體反應(yīng)可分為兩個(gè)階段 特異性結(jié)合階段 可見(jiàn)的反應(yīng)階段,抗原和抗體結(jié)合是否呈現(xiàn)可見(jiàn)的反應(yīng)現(xiàn) 象，于兩者的分子

20、比例密切相關(guān),40,抗原抗體比例對(duì)反應(yīng)現(xiàn)象的影響,41,42,二﹑抗原-抗體反應(yīng)受多種因素影響,1 電解質(zhì)：抗原-抗體反應(yīng)通常應(yīng)用0.85%的氯化鈉作為稀釋液 ，以供給適應(yīng)濃度的電解質(zhì)。2 溫度：一般常使用反應(yīng)在37度水浴 或孵育箱中進(jìn)行。3.酸堿度：抗原-抗體反應(yīng)適應(yīng)的酸堿度 為PH6--8。4.抗原抗體比例,抗原-抗體反應(yīng)受多種因素影響,43,第二節(jié) 抗原抗體的檢測(cè)方法,凝集反應(yīng)沉淀反應(yīng)補(bǔ)體溶血反應(yīng)和補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)中和反

21、應(yīng)用標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng),44,一.凝集反應(yīng) (Agglutination),細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆粒性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后形成凝集 現(xiàn)象，稱為凝聚反應(yīng)。 (1)、直接凝集：將細(xì)菌或紅細(xì)胞與相應(yīng)的抗體直接反應(yīng)，出現(xiàn)細(xì)菌凝集或紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。又分為玻片法和試管法。 (2)、間接凝集：將可溶性抗原包被在紅細(xì)胞或乳膠顆粒表面，與相應(yīng)抗體反應(yīng)出現(xiàn)顆粒凝集現(xiàn)象。,45,血 球 凝 集,46,47,二.沉淀反應(yīng) （Precipitat

22、ion),血清蛋白質(zhì)、細(xì)胞裂解液或組織浸液等可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后出現(xiàn)沉淀物，這一類反應(yīng)稱為沉淀反應(yīng)。沉淀反應(yīng)可在液體中進(jìn)行，如絮狀沉淀。大多沉淀反應(yīng)是用半固體瓊脂凝膠為介質(zhì)，進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散故也稱免疫擴(kuò)散。 1.單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn) 2.火箭電泳 3.雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn) 4.對(duì)流免疫電泳,48,49,50,51,52,三.免疫標(biāo)記技術(shù),用熒光素、同位素或酶等示蹤物質(zhì) 標(biāo)記抗體（或抗原）進(jìn)行抗原-抗體反應(yīng)。標(biāo)

23、記物質(zhì)與抗體（或抗原）的化學(xué)連接未改變抗體（或抗原）的免疫學(xué)特性，同時(shí)標(biāo)記物的性質(zhì)依然存在，因而極大的提高了反應(yīng)的靈敏度，可以對(duì)微量物質(zhì)進(jìn)行定量、定性或定位檢測(cè)。免疫標(biāo)記技術(shù)主要有四種基本類型：免疫熒光技術(shù)、免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)、免疫酶技術(shù)和同位素標(biāo)記技術(shù)。,53,1.免疫熒光顯微技術(shù),用熒光素（常用的有異硫氰酸熒光素），與抗體連接成熒光抗體，再與待測(cè)標(biāo)本的抗原反應(yīng)，置熒光顯微鏡下觀察，抗原抗體復(fù)合物散發(fā)出熒光，借此對(duì)標(biāo)本中的抗原作鑒定和

24、定位。 包括直接熒光法、間接熒光法和補(bǔ)體法。,,,54,間接免疫熒光法示意圖,55,56,用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法；用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法。因?yàn)闊晒馍夭坏芘c抗體球蛋白結(jié)合，用于檢測(cè)或定位各種抗原，也可以與其他蛋白質(zhì)結(jié)合，用于檢測(cè)或定位抗體，但是在實(shí)際工作中熒光抗原技術(shù)很少應(yīng)用，所以人們習(xí)慣稱為熒光抗體技術(shù)，或稱為免疫熒光技術(shù)。,2.免疫熒光測(cè)定技術(shù),57,（1）時(shí)間分辨

25、熒光免疫技術(shù),原理：TRFIA 是用三價(jià)稀土離子及其螯合劑作為示蹤物，如銪（Eu3+) 來(lái)標(biāo)記抗體、抗原，待反應(yīng)體系發(fā)生后，用時(shí)間分辨熒光儀測(cè)定最后產(chǎn)物中的熒光強(qiáng)度，根據(jù)熒光強(qiáng)度和相對(duì)熒光強(qiáng)度比值，判斷反應(yīng)體系中分析物的濃度，達(dá)到定量分析的目的。,58,優(yōu)點(diǎn)：技術(shù)集酶標(biāo)記、同位素標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)于一身，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、標(biāo)記物制備簡(jiǎn)便、儲(chǔ)存時(shí)間長(zhǎng)、無(wú)放射性污染、檢測(cè)重復(fù)性好、操作流程短、標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍寬和應(yīng)用范圍廣泛等優(yōu)點(diǎn)，

26、,59,注意：所用試劑和器材務(wù)必防塵； Eu3+標(biāo)記物的溶解和稀釋必須盡 量準(zhǔn)確，務(wù)必在加樣1小時(shí)內(nèi)配制。,60,（2）電化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù),原理：電化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)是繼放射免疫分析法、酶免疫分析法、熒光免疫分析法、化學(xué)發(fā)光免疫分析法后的最先進(jìn)的免疫分析方法。電化學(xué)發(fā)光（ECL）是一種在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，實(shí)際上包括了電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光兩個(gè)過(guò)程。直接以[Ru(bpy)3]2+標(biāo)記抗體，反

27、應(yīng)時(shí)標(biāo)記物直接發(fā)光。且[Ru(bpy)3]2+在電極表面的反應(yīng)過(guò)程可以周而復(fù)始進(jìn)行，產(chǎn)生許多光子，使光信號(hào)得以增強(qiáng)。,61,優(yōu)點(diǎn)：非放射性標(biāo)記物避免了放射性核素的污染；磁性微粒（2.8µm）為固相載體表面積大，吸附率高，近似均相免疫反應(yīng)； 鏈霉親和素與生物素是最特異及牢固的結(jié)合；應(yīng)用范圍廣；檢測(cè)敏感度高；檢測(cè)所需樣本量少。,62,2.酶免疫測(cè)定(Enzyme Immunoassay, EIA),是用酶（常用的有辣根過(guò)氧化物酶

28、HRP和堿性磷酸酶AP) 標(biāo)記的抗體進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。EIA將抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶催化作用的高效性相結(jié)合，通過(guò)酶作用于底物后顯色來(lái)判定結(jié)果。常用的方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和酶免疫組化法，前者測(cè)定可溶性抗原或抗體，后者測(cè)定組織或細(xì)胞表面的抗原。,63,(1).酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA),將已知的抗原或抗體吸附在固相載體（聚苯乙烯微量反應(yīng)板）表面，使抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行。用洗滌法將液相中游離成分洗除。主要有雙抗體夾心法、間接法

29、BAS-ELISA等。 (2) ELISA方法有:a.雙抗體 / 抗原夾心法測(cè)抗原 / 抗體: 包被在固相載體上的抗體 / 抗原與加入的待測(cè)抗原 / 抗體及酶標(biāo)抗體 / 抗原三者在一定條件下進(jìn)行溫育反應(yīng)，若待測(cè)樣本中含有特異性抗原 / 抗體，則在孔內(nèi)形成抗體 / 抗原-抗原 / 抗體-酶復(fù)合物, 經(jīng)過(guò)嚴(yán)格洗滌后,復(fù)合物與底物作用后將顯色。,64,b.間接法測(cè)抗體： 將抗原包被在固相載體上，樣本中含有特異性抗體則結(jié)

30、合成抗原－抗體復(fù)合物，再與加入的酶標(biāo)記抗抗體結(jié)合, 形成抗原－抗體－酶標(biāo)抗抗體復(fù)合物。酶催化底物顯色。C.竟?fàn)幏y(cè)抗體： 包被抗原于固相載體上，檢測(cè)時(shí)加入樣本和酶標(biāo)記抗體，如樣本中含有特異性抗體將與酶標(biāo)記抗體竟?fàn)幣c包被的固相抗原結(jié)合形成抗原－抗體復(fù)合物，固相上無(wú)酶催化底物，而不顯色。,65,包被抗體于固相載體上，檢測(cè)時(shí)加入樣本、中和抗原和酶標(biāo)記抗體，如待測(cè)樣本中含有特異性抗體將與固相抗體竟?fàn)幹泻涂乖Y(jié)合形成抗體－抗原－抗體復(fù)

31、合物，固相上無(wú)酶催化底物，而不顯色。d. 固相捕獲法測(cè)IgM抗體： 將抗抗體（抗人µ鏈）包被于固相載體上，如樣本中含有特異性抗體則結(jié)合成抗抗體－抗體復(fù)合物，加入抗原及酶標(biāo)記抗體則進(jìn)一步形成抗抗體－抗體－抗原－酶標(biāo)記抗體復(fù)合物。酶催化底物并顯色。,66,67,68,ELISA原理及分類,69,3.膠體金法,膠體金法，又稱金標(biāo)法，是一種常用的標(biāo)記技術(shù)，是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)。目

32、前在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用主要是免疫層析法和快速免疫金滲濾法，具有簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確和無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)。各類快速檢測(cè)試紙均采用免疫層析法，大量以塑料為載體的快速檢測(cè)塊均采用快速免疫金滲濾法,70,層析法免疫膠體金檢測(cè)試劑結(jié)構(gòu)示意圖,71,C1—金標(biāo)記鼠抗人HCG;T—金標(biāo)記鼠抗人HCG+HCG+抗HCG; (測(cè)定區(qū)) C2---多余金標(biāo)記鼠抗人HCG+羊抗小鼠HCG.(質(zhì)控區(qū))此圖為雙抗體夾心法，顯色為陽(yáng)性；競(jìng)爭(zhēng)法相反。,

33、72,第三章 肝炎標(biāo)志物檢測(cè),,南充中心醫(yī)院免疫室 李欣,73,第一節(jié) 五型肝炎病毒,一.乙型肝炎病毒 乙型肝炎病毒（HBV）是具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的DNA病毒，核心內(nèi)含有一雙股DNA和DNA聚合酶，外面有一層含有表面抗原（HBsAg）的外衣 HBV的抗原復(fù)雜，其外殼中有表面抗原，核心成分中有核心抗原和e抗原，感染后可引起機(jī)體的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。HBV感染的種屬范圍很窄，只局限于人和黑猩猩。 1. 乙型肝炎表面

34、抗原(HBsAg)和表面抗體(抗-HBs)HBsAg存在于病毒顆粒的外殼以及小球形顆粒和管狀顆粒。于感染后2-12周，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)升高前，即可由血內(nèi)測(cè)到， HBsAg有“a”、“b”、“y”、“r”、“w”等多種抗原決定簇，其中“a”是共同的抗原決定簇，在我國(guó)的主要是adr亞型。,74,乙肝病毒解剖模型（1）,75,乙肝病毒解剖模型（2）,76,抗-HBs對(duì)同型感染具有保護(hù)作用。近期感染者所產(chǎn)HBs屬IgM，而長(zhǎng)期存在血中的為

35、抗-HBsIgG。 前S1及前S2蛋白具有與HBsAg不同的抗原。完整的HBV顆粒含有S蛋白及前S2蛋白，而缺陷病毒顆粒則無(wú)前S1蛋白。血清中出現(xiàn)前S1、前S抗原是HBV活動(dòng)性復(fù)制的標(biāo)志。 HBsAg陽(yáng)性患者原發(fā)性肝癌的發(fā)病概率為正常人的200倍以上； 2. HBcAg主要存在于受染的肝細(xì)胞核內(nèi)，復(fù)制后被釋至胞漿中，由胞漿中形成的HBsAg包裹，裝配成完整的病毒顆粒后釋放入血。血液中一般不能查到游離的HBcAg。血中的

36、Dane顆粒經(jīng)去垢劑處理后可以查到其核心部分的HBcAg和DNA聚合酶。,77,早期出現(xiàn)者主要是抗-HBcIgM，是近期感染的重要標(biāo)志；抗-HBcIgG出現(xiàn)較遲，但可長(zhǎng)期存在?？?HBc對(duì)HBV感染無(wú)保護(hù)作用。血清中抗-HBcIgM陽(yáng)性表明體內(nèi)有HBV復(fù)制，且有肝細(xì)胞損害；若抗-HbcIgG陽(yáng)性且滴度高，伴以抗-HBs陽(yáng)性，則為乙型肝炎恢復(fù)期；若抗-HBcIgG呈低滴度，抗-HBcIgM陰性，而抗-HBs陽(yáng)性，則是既往感染的標(biāo)志。3.

37、 HBeAg僅存在于HBsAg陽(yáng)性者的血液中，通常伴有肝內(nèi)HBVDNA的復(fù)制，血中存在較多Dane顆粒和HBVDNA聚合酶活性增高，因此，HBeAg陽(yáng)性是病毒活動(dòng)性復(fù)制的重要指標(biāo)，傳染性高。急性肝炎患者若HBeAg持續(xù)陽(yáng)性10周以上，則易于轉(zhuǎn)為持續(xù)感。,78,HBV是通過(guò)接觸、血液及血制品、母嬰垂直傳播等方式傳播。在我國(guó)約有60％的乙肝病毒攜帶者是通過(guò)母嬰垂直傳播的。二.甲型肝炎病毒（HAV） HAV屬微小核糖核酸病毒

38、 (RNA)主要引起急性感染，經(jīng)糞－口途徑傳播，有季節(jié)性，可引起暴發(fā)流行。三.丙型肝炎抗體(HCV) 測(cè)定丙型肝炎抗體是判定急、慢性丙型肝炎的重要指標(biāo)。丙型肝炎病毒（HCV）是一種具有脂質(zhì)外殼的RNA病毒 HCV感染者血中的HCV濃度極低，抗體反應(yīng)弱而晚，血清抗-HCV在感染后平均18周陽(yáng)轉(zhuǎn)，至肝功能恢復(fù)正常時(shí)消退，而慢性患者抗-HCV可持續(xù)多年并具有傳染性。,79,在2個(gè)月左右的潛伏期后，只有大約四分之一的病人會(huì)出現(xiàn)食欲

39、差、疲倦、黃疸等癥狀；而大部分的患者卻沒(méi)有任何感覺(jué)。而且，感染后大約要經(jīng)過(guò)二十年左右才會(huì)出現(xiàn)肝硬化。因此，有很多人根本不知道自己經(jīng)感染。而丙肝可導(dǎo)致肝臟慢性炎癥壞死和纖維化，部分患者可發(fā)展為肝硬化甚至肝細(xì)胞癌（HCC），對(duì)患者的健康和生命危害極大 HCV主要通過(guò)輸血和血制品來(lái)進(jìn)行傳播。,四.丁型肝炎病毒(HDV) 是一種缺陷的嗜肝單鏈RNA病毒，需要HBV的輔助才能進(jìn)行復(fù)制，因此HDV和HBV同時(shí)或重疊感染。,80,五.

40、戊型肝炎病毒（HEV） HEV對(duì)氯仿敏感，在4℃或—20℃下易被破壞，在鹼性環(huán)境中較穩(wěn)定。HEV存在于替伏末期及發(fā)病初期的患者糞便中。有明顯的季節(jié)性，多散發(fā)于雨季后，糞口傳播是主要的傳播途徑。甲型和戊型肝炎病毒主要引起急性感染，經(jīng)糞－口途徑傳播，有季節(jié)性，可引起暴發(fā)流行。乙、丙、丁型肝炎常表現(xiàn)為慢性經(jīng)過(guò)，主要經(jīng)血液傳播，無(wú)季節(jié)性，多為散發(fā)，并可發(fā)展為肝硬化和肝細(xì)胞癌。,81,第二節(jié) 五型肝炎病毒 （抗體）檢測(cè),,8

41、2,類風(fēng)濕性因子（RF）：是一種以變性IgG為靶抗原的自身抗體，主要存在于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的血清和關(guān)節(jié)液中，它是一種抗變性IgG的抗體，可與IgGFc段結(jié)合。檢測(cè)方法一般有膠乳凝集試驗(yàn)、雙抗原夾心ELISA法、速率散射比濁法。膠乳凝集試驗(yàn) ：將變性IgG包被于聚苯乙烯膠乳顆粒上，這種致敏膠乳在與待測(cè)血清中的RF相遇時(shí)，即發(fā)生肉眼可見(jiàn)的凝集。正常人1：20稀釋血清為陰性，操作要求56℃30分鐘滅活，（滅活C1q以阻止假陽(yáng)性凝集）。,

42、第三節(jié) 類風(fēng)濕診斷,83,臨床意義：未經(jīng)治療的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者其陽(yáng)性率為80%，且滴定度常在1：160以上。 RF不是僅在RA患者中出現(xiàn)，在SLE、進(jìn)行性全身性硬化癥等自身免疫性疾病患者和部分老年人中RF的陽(yáng)性率可達(dá)28.9%--50%，因而RF對(duì)RA患者并不具有嚴(yán)格特異性，,抗鏈球菌溶血素“O”，簡(jiǎn)稱抗“O”或ASO 溶血性鏈球菌產(chǎn)生的一種代謝產(chǎn)物能溶解紅細(xì)胞，所以這種產(chǎn)物被取名為“O”溶血素，人體感染了A組溶血性

43、鏈球菌后，“O”溶血素在體內(nèi)作為一種抗原物質(zhì)存在。為了測(cè)定這種能中和鏈球菌溶血素“O”的抗體含量，就稱為抗鏈球菌溶血素“O”試驗(yàn)。,84,臨床意義:溶血性鏈球菌感染、猩紅熱、丹毒、鏈球性咽炎、扁桃體炎。對(duì)風(fēng)濕熱、急性腎小球腎炎有間接診斷價(jià)值、若多次檢測(cè)結(jié)果遞增，并伴紅細(xì)胞沉降率加快可有助于診斷。,85,第四章 免疫學(xué)檢驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)量控制 （ELISA）,南充中心醫(yī)院免疫室 李欣,86,質(zhì)量管

44、理的基本要求,免疫檢驗(yàn)要保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠、及時(shí)、有效，并盡可能使各實(shí)驗(yàn)室間檢驗(yàn)結(jié)果可比性，這是免疫檢驗(yàn)質(zhì)量保證的基本目的。ELISA實(shí)驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)控的重點(diǎn)是對(duì)低值弱陽(yáng)性標(biāo)本檢測(cè)的精密性進(jìn)行檢測(cè)。臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)主要采用血清標(biāo)本，檢驗(yàn)項(xiàng)目既有傳染性病原體的抗原及抗體，還有腫瘤標(biāo)志物、激素、特種蛋白、細(xì)胞因子、治療藥物等；既有定量檢測(cè)，又有定性檢測(cè)。,87,一、分析前質(zhì)量保證,主要是患者準(zhǔn)備、標(biāo)本的正確采集、輸送及保存。防止溶血、乳糜血

45、、血液污染，治療藥物及激素測(cè)定還應(yīng)注意采集標(biāo)本的時(shí)間，甚至患者體位都能影響檢測(cè)結(jié)果。溶血標(biāo)本會(huì)增加非特異性顯色造成假陽(yáng)性。 儀器保持最佳工作狀態(tài)。所要控制的儀器包括移液器（加樣槍），水浴箱（溫箱），洗板機(jī)和酶標(biāo)儀。,88,1.加樣：加標(biāo)本應(yīng)用微量移液器，按規(guī)定的量加至微孔板孔底的 1/3 處，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。加每份標(biāo)本應(yīng)更換吸嘴，干吸頭預(yù)先在樣本中抽吸三次。滴瓶滴加試劑時(shí)，應(yīng)先將滴瓶搖勻并擠去

46、第 1 滴有氣泡的試劑，注意垂直加樣，并力求量的一致。,一、分析中質(zhì)量保證,89,2.溫育應(yīng)嚴(yán)格按照試劑盒要求選擇溫育次數(shù)和間，力求準(zhǔn)確、一致。溫育采用能使反應(yīng)液迅速達(dá)到平衡的水浴法。為減少邊緣效應(yīng)，水要浸至板條的1/3處，不可將板條疊加放置?？杉臃饽l以防止蒸發(fā)。,90,3.洗滌,甩去孔內(nèi)反應(yīng)液。用洗滌液過(guò)洗一遍（即注滿孔后即刻甩去）。將微孔重新注滿洗液后浸泡 1-2 分鐘，間歇搖動(dòng)。甩去孔內(nèi)液體，拍板，用紙徹底吸

47、干。重復(fù)以上操作至少 5 次，注意各種試劑盒的洗滌液盡量不要混用。洗板機(jī)洗滌時(shí)一定按要求設(shè)置洗滌參數(shù)，務(wù)必要板架放平 ，填充孔不能高于標(biāo)本孔，標(biāo)本孔不能有凝塊，以免堵孔。,91,4.顯色及判讀結(jié)果,注意加顯色液次序和顯色時(shí)間。比色前務(wù)必擦干板底。注意灰區(qū)值的判定及處理 。,92,一、分析后質(zhì)量保證,鉤狀效應(yīng)現(xiàn)象若樣本中抗原濃度過(guò)高，會(huì)出現(xiàn)高濃度后帶現(xiàn)象，此時(shí)免疫反應(yīng)被明顯抑制，測(cè)定結(jié)果偏低。要消除此干擾，只有對(duì)樣本進(jìn)行適當(dāng)稀釋后

48、重新測(cè)定。對(duì)雙抗體夾心法則抗原時(shí)出現(xiàn)的假陰性標(biāo)本需稀釋（1：250、1：500、1：1000）后重測(cè)。,灰區(qū)值需重復(fù)實(shí)驗(yàn)或換試劑重測(cè)以確定其陰陽(yáng)性，如仍落在灰區(qū)范圍內(nèi)則報(bào)告陽(yáng)性。,93,一步法ELISA抗原濃度與顯色變化的反映曲線,94,二步法ELISA抗原濃度與顯色變化的反映曲線,95,對(duì)某些罕見(jiàn)模式，必須進(jìn)行復(fù)查。試劑盒陰性、陽(yáng)性對(duì)照或標(biāo)準(zhǔn)濃度系列：陰性對(duì)照值≤ 0.05，陽(yáng)性對(duì)照值＞ 0.8 ，（陽(yáng)性對(duì)照值－陰性對(duì)照值）＞