第二章 免疫組織化學(xué)的基本理論與技術(shù)

1、第二章 免疫組織化學(xué)的基本理論與技術(shù),一、免疫組織化學(xué)的基本理論1 原理：免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry) 是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，使標(biāo)記抗體的顯色劑 (熒光素、酶、金屬離子、同位素) 顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì))，對其進(jìn)行定位、定性及定量的研究。 可在光鏡和電鏡水平觀察細(xì)胞膜及細(xì)胞內(nèi)某種抗原物質(zhì)的存在，從而為研究生命大分子，特別是酶、蛋白質(zhì)、激素及受體蛋白等在組織內(nèi)分布、細(xì)

2、胞內(nèi)定位以及代謝狀態(tài)等，提供了特異性強(qiáng)、靈敏度高而又直觀化的原位分析細(xì)胞組成物質(zhì)的手段。,2 免疫組織化學(xué)全過程包括: ⑴ 抗原提?、?抗體制備 (博士德,華美,基因公司等購買)⑶ 抗體標(biāo)記⑷ 免疫染色⑸ 觀察分析等過程,二、抗原與抗體,1.抗原 Ag 定義：是指能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，并與相應(yīng)的免疫產(chǎn)物（抗體）發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)。 蛋白質(zhì)：免疫原性最強(qiáng)； 多糖：免疫原性次之； 脂類和核酸：必需

3、和蛋白質(zhì)及多糖形成復(fù)合物才具有良好的免疫原性。,2.抗體 Ab 定義：是機(jī)體受到抗原刺激后，由免疫細(xì)胞合成并分泌出 一類具有與抗原發(fā)生特異性結(jié)合的球蛋白。 存在部位：主要存在于血清內(nèi)。 分類：根據(jù)重鏈的結(jié)構(gòu)及抗原特異性不同分為五種， 即IgG、 IgD、IgE、IgA、IgM。 根據(jù)制備方法不同分為兩種 即單克隆抗體與多克隆抗體,IgG的結(jié)構(gòu),IgG分

4、子呈“Y”型由兩條L鏈和兩條H鏈組成。用木瓜酶水解IgG可得到3個(gè)片段：兩個(gè)相同F(xiàn)ab段或抗原結(jié)合段和另一Fc段或可結(jié)晶段。在Fab段與Fc段之間有一個(gè)對酶敏感的區(qū)域，稱鉸鏈區(qū)。,多克隆抗體,制備原理：將純化的抗原注射入動(dòng)物體內(nèi)時(shí)，一系列抗體生成細(xì)胞會(huì)不同程度的與抗原結(jié)合，受抗原刺激后在血液中產(chǎn)生不同類型的抗體，這種由一種抗原刺激產(chǎn)生的抗體稱為多克隆抗體。,單克隆抗體,Ag,合成抗體,,效應(yīng)性B 細(xì)胞(漿細(xì)胞),不能在體外生長,瑞士

5、Kohler,英國Milstein,多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞,多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞,,不能合成抗體,能在體外大量繁殖,,,脾,多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞,,,,,,,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,,一抗,,單克隆抗體,多克隆抗體,,,缺點(diǎn):價(jià)格較高，容易出現(xiàn)假陰性反應(yīng)。,實(shí)質(zhì):是受同一種抗原刺激，由多個(gè)B淋 巴細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的抗體混合物。,優(yōu)點(diǎn):容易制備，價(jià)格便宜,缺點(diǎn):可能與多種

6、特異性和非特異性的抗原決定簇反應(yīng)，出現(xiàn)非特異性染色，影響結(jié)果的判定。,實(shí)質(zhì):是受同一種抗原刺激，由單個(gè)B淋 巴細(xì)胞克隆所分泌的抗體。,優(yōu)點(diǎn):特異性強(qiáng)，敏感性高，抗體產(chǎn)量高。,首選,三、免疫組織化學(xué)的基本技術(shù),免疫組織化學(xué)技術(shù)是用標(biāo)記物或顯色物標(biāo)記的抗原(或抗體)檢測組織和細(xì)胞內(nèi)的抗原，從而達(dá)到診斷或研究的目的。特定抗原(或抗體)的顯示和定位是否準(zhǔn)確與細(xì)胞和組織標(biāo)本制各的質(zhì)量好壞有著密切關(guān)系。因此，組織和細(xì)胞標(biāo)本的取材和制備至關(guān)重要

7、。,1.組織標(biāo)本制備（1）標(biāo)本新鮮：一般在2h以內(nèi)進(jìn)行。（2）取材部位：取含待檢抗原部位，還應(yīng)取病灶與正常交界處，即抗原陽性和陰性區(qū)，必要時(shí)取遠(yuǎn)離病變區(qū)的正常組織作為對照。對于只研究正常組織抗原，取材時(shí)應(yīng)盡可能避開壞死區(qū)。（3）避免擠壓：剪刀、刀片的刃口要鋒利。（4）取材大小：做石蠟切片的組織厚度不宜超過2mm，用作冰凍切片的以4mm為宜。（5）固定:化學(xué)固定,或于液氮中,或－70℃冰箱中保存。,2．細(xì)胞標(biāo)本制備,(1)印片

8、法應(yīng)用：活檢標(biāo)本、手術(shù)切除的標(biāo)本。方法：將新鮮標(biāo)本暴露病區(qū),用載玻片輕壓病區(qū)，脫落細(xì)胞粘附于載玻片上，立即浸入固定液中5-10min，取出后自然干燥，低溫保存。優(yōu)點(diǎn)：簡便省時(shí)，細(xì)胞抗原保存較好。缺點(diǎn)：細(xì)胞分布不均、重疊,影響觀察效果,(2) 穿刺吸取涂片法 應(yīng)用：實(shí)質(zhì)器官的病變區(qū)。 方法：①穿刺液較少時(shí)直接涂片,力求均勻。 ②穿刺液較多時(shí)，穿刺液滴入2毫升 Hanks液內(nèi)，離心，

9、制成細(xì)胞懸 液，吸一滴于載玻片上，輕涂， 干燥后固定。 優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞均勻。 缺點(diǎn)：細(xì)胞易變形。,(3)體液沉淀涂片法 1) 細(xì)胞數(shù)較多，取一滴直接涂片。 2) 細(xì)胞數(shù)較少時(shí)，取5毫升自然沉淀液以1500rpm離心10min，棄上清，將沉淀涂片，略干后固定備用。,（4）體外培養(yǎng)細(xì)胞 1)貼壁生長的細(xì)胞：將蓋玻片插入培養(yǎng)液中，讓細(xì)胞自然貼壁于蓋玻片上。 2)懸浮生

10、長的細(xì)胞：可用離心涂片機(jī)法制成涂片。 （5）離心涂片機(jī)法 制成2×105-6／ml細(xì)胞懸液,取50～100μl，加入涂片機(jī)內(nèi)，1000r／min, 2min，細(xì)胞即可均勻分布于載玻片上。,（二）免疫組織化學(xué)的固定方法,免疫組織化學(xué)固定的原則：最好地保存細(xì)胞和組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)和最大限度地保存抗原的免疫活性。方法：一）固定有物理固定，如血涂片可采用空 氣快速干燥、凍結(jié)干燥等；二）化學(xué)固定,1．浸入法： 組織

11、立即浸于固定液內(nèi),時(shí)間在2～12h之間。2．灌注法： 插管由左心室插入主動(dòng)脈,先用PBS沖洗血液,再 以泵或吊瓶灌注固定液。在灌注后30min內(nèi)取材, 再置同一固定液內(nèi)浸入固定l～3h。可使固定液 到達(dá)全身各處組織。3．微波固定： 微波處理后,溫度升高,分子運(yùn)動(dòng)加快,促進(jìn)固定 液向組織內(nèi)滲透,短時(shí)間達(dá)到固定效果。將標(biāo)本 放入5～10ml固定液內(nèi),置于爐中央,周邊放一燒 杯盛400純水以

12、吸收爐內(nèi)產(chǎn)生的熱量,選擇強(qiáng)檔照 射10～30s,照后固定液溫度≤50℃。取出后,在 相同固定液內(nèi)再固定2～6h(室溫)。,（三）重要固定液,(1) 醛類固定劑: 為雙功能交聯(lián)劑, 可使組織間相互交聯(lián)，將抗原保存于原位。特點(diǎn)是對組織的穿透性強(qiáng)，收縮性小.是常用固定劑。1) 10％中性緩沖福爾馬林：該固定劑易使組織硬化而致浸蠟困難，因此固定時(shí)間不宜過長。2) 4％多聚甲醛磷酸緩沖液：適應(yīng)性較廣泛，因較溫和，適于組織標(biāo)本的較長

13、時(shí)期的保存。3) Bouin's液：對組織固定力強(qiáng)且較均勻。比單獨(dú)醛類固定更適和免疫組化染色，較常用，通常4℃下固定6～8h。4) Zamboni液：用于光、電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)觀察。,(2) 非醛類固定劑： 為非醛類雙功能試劑，單獨(dú)應(yīng)用時(shí)，邊緣固定效應(yīng)較重，但與戊二醛或多聚甲醛混合使用時(shí)，效果明顯好轉(zhuǎn)。較適用于多肽類激素的組織固定。1) 碳化二亞胺液: 適用于含多肽激素組織的固定。2) 碳二亞酰胺一戊二醛液(ECD—G

14、液)：對酶等蛋白質(zhì)固定效果良好，對細(xì)胞內(nèi)抗原定位，超微結(jié)構(gòu)保存好，是培養(yǎng)細(xì)胞電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)的良好固定劑，也常用于多肽類激素固定。3) Zenker’s液：因含重金屬，固定時(shí)間要短，以2～4h為宜。染色前必須脫汞。,(3) 丙酮及醇類固定劑： 其作用是沉淀蛋白質(zhì)和糖，對組織穿透性很強(qiáng)，能夠較好地保存抗原的免疫活性。但醇類對低分子蛋白、多肽及胞漿蛋白質(zhì)的保存效果較差。與冰醋酸、氯仿、甲醛等混合使用，效果可明顯改善。1) 丙酮：

15、常用于冰凍切片及細(xì)胞涂片的后固定。保存抗原性較好，穿透性及脫水性較強(qiáng)。2) 95%乙醇：用于冰凍切片及細(xì)胞涂片的后固定。效果較差,和其他試劑混合使用,染色較好。3) AAF液：較常用的固定液。(95～100％乙醇85ml，冰醋酸5ml，濃甲醛10m1)。 4) Carnoy液：100％乙醇醇60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml，混合后4℃保存?zhèn)溆谩?3．固定劑的選擇 固定劑的種類很多，至今尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的固定劑，10％中

16、性甲醛是國際最通用的固定劑。需指出，同一固定液固定的組織，染色結(jié)果可截然不同；不同的抗原和不同的組織標(biāo)本往往需反復(fù)試驗(yàn)，必要時(shí)可做多種固定液對比，才能選出最佳的固定液。,(四) 組織包埋和切片技術(shù),固定的和未經(jīng)固定的組織、細(xì)胞以及各種涂片和切片方法均可用于免疫組化，但其效果不同。光鏡免疫組織化學(xué)的切片厚度一般為4～6μm，而神經(jīng)組織切片通常為20～100μm厚，以便顯示神經(jīng)纖維的走行。,1．冰凍切片 冰凍切片(frozen se

17、ction)是酶組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)染色中最常用的一種切片方法。 優(yōu)點(diǎn)：1）能較好地保持抗原活性(尤其是表面 抗原)和酶的活性。 2）冰凍切片簡便快速，省去固定、包埋 和切片處理等一系列繁瑣步驟。 適用范圍：新鮮的組織及已固定的組織均可作 冰凍切片。 缺點(diǎn)：1）不能用于回顧性研究。 2）不利于常規(guī)檢查和長期保存標(biāo)本。

18、 3）不如石蠟切片結(jié)構(gòu)清晰。,（1）冷凍、包埋 為防止冷凍中形成冰晶破壞組織結(jié)構(gòu)和保持抗原，采?。?) 浸入深低溫預(yù)冷的（干冰容器內(nèi)，-70℃)正已烷液內(nèi)驟冷30～60秒，或用OCT包埋劑浸透，使組織速凍，溫度驟降，減少冰晶的形成。方法：①干冰-丙酮法： ②液氮法：2) 將固定后或未固定的組織置于20％-30％蔗糖溶液l～3天。利用高滲吸收中水份;減少組織含水量。包埋、冷凍步驟同上。,(2) 切片

19、 技術(shù)難度較大，選擇好的冰凍切片機(jī)是保證切片質(zhì)量的關(guān)鍵。 1) 恒冷箱切片機(jī)(cryostat)—常用、理想的切片機(jī)： 切片機(jī)置于-30℃低溫密閉室內(nèi)，可連續(xù)切薄片．切片時(shí)，低溫室內(nèi)溫度以-15～-18℃為宜，溫度過低組織易破碎。 2) 開放式冰凍切片機(jī)：切片時(shí)暴露空氣中，切片技術(shù)難度大。在高溫季節(jié)，切片更加困難，目前處于淘汰階段。,(3) 冰凍切片的保存使用 如不染色，必須室溫下吹干30min以上，裝入

20、密封的標(biāo)本盒內(nèi)，外包塑料袋，置于-20℃低溫冰箱，一個(gè)月內(nèi)使用。 染色前，從冰箱內(nèi)取出切片，置室溫干燥10min，再經(jīng)丙酮固定5～10min(未固定者)，即可進(jìn)入染色程序。,2. 石蠟切片 石蠟切片(paraffin secfion)：指在切片前，固定的組織塊需經(jīng)乙醇逐級脫水，二甲苯透明，再浸蠟包埋。 組織在浸蠟、包埋時(shí)，石蠟溫度應(yīng)低于60℃，各步驟時(shí)間均不宜過長(1～2h)，以免組織變脆。

21、切片一般厚約3～5μm，切片于37℃烘烤過夜，可置4℃保存，脫水、透明也可在4℃進(jìn)行。（詳見組織學(xué)與胚胎學(xué)第六版）,3．振動(dòng)切片 振動(dòng)切片是將新鮮組織(不固定不冷凍，或低濃度固定液稍稍固定)后用振動(dòng)切片機(jī)切成20～100μm厚，漂浮免疫組化染色，檢出陽性部位，后固定，常規(guī)電鏡樣品制備。適于免疫電鏡細(xì)胞化學(xué)觀察。,4． 塑料包埋切片(plastic section) 常用的包埋材料有兩大類：甲基丙烯酸鹽類和環(huán)氧樹脂

22、類。 前者能較好地保存抗原，不與組織產(chǎn)生共聚合，染色前不必脫去包埋材料，但形態(tài)結(jié)構(gòu)欠佳，切片易皺折； 后者能較好地保持形態(tài)結(jié)構(gòu)，但在聚合過程中易與組織作用，改變抗原結(jié)構(gòu)。 優(yōu)點(diǎn)：組織塊可同時(shí)用于一般光鏡切片、半薄切片(0.5～1.5μm)和電鏡超薄切片。 缺點(diǎn)：所經(jīng)步驟繁瑣，抗原活性易喪失。 應(yīng)用范圍：塑料包埋切片主要用于免疫電鏡超薄切片前定位。,5. 超薄切片 超薄切片(ultrathin section

23、)適用于免疫電鏡細(xì)胞化學(xué)，需用超薄切片機(jī)(詳見有關(guān)電鏡技術(shù)資料)。6．載玻片及蓋玻片的處理和切片的附貼(1)載玻片及蓋玻片的處理 1)載玻片：清洗液(酸)浸泡12-24h，水洗，95％乙醇浸泡2h后擦干或烤干。 2)蓋玻片：清洗液浸泡2h，或鹽酸乙醇浸泡后水洗，95％乙醇浸泡，擦干。,(2) 切片的附貼 為防止染色過程脫片，適用免疫組化染色中的附貼劑：1)甘油．明膠；2)甲醛一明膠；3）鉻明礬-明膠；4）多聚賴

24、氨酸(Poly-L-Lysine)；5）APES；6）APES和Poly-L-lysine聯(lián)合應(yīng)用：適于特別容易脫片的情況。,（五）免疫組織化學(xué)的染色方法及注意事項(xiàng),一）免疫組織化學(xué)染色方法1.按標(biāo)記物種類分為： 免疫酶法； 免疫金一銀法； 鐵標(biāo)記法； 免疫熒光法； 雙重或多重免疫染色法等。,2. 按標(biāo)記抗體不同分為: （1）直接法： 抗原 + 一抗（標(biāo)記物標(biāo)記） 鏡下觀察

25、 優(yōu)點(diǎn)：簡單，時(shí)間短，特異性強(qiáng)。 缺點(diǎn)：靈敏度差，所需抗體量大，不經(jīng)濟(jì)，淘汰。,（2） 間接法：經(jīng)過二次抗體抗原 + 一抗 + 二抗（標(biāo)記物標(biāo)記） 特點(diǎn)：較直接法靈敏，可標(biāo)記一種抗體→鑒定多種抗原。,（3） 非標(biāo)記抗體橋法（橋連法、多步法） 經(jīng)過三次抗體特點(diǎn)：任何抗體均未被酶標(biāo)記； 酶是與抗酶 抗體結(jié)合，避免因共價(jià)結(jié)

26、合對抗體和酶活性的影響，提高敏感性，節(jié)約一抗用量。 抗標(biāo)記物抗體（用與一抗同種動(dòng)物產(chǎn)生） 抗標(biāo)記物抗體 + 標(biāo)記物 = 免疫復(fù)合物(如PAP，APAAP), 抗原 + 一抗 + 二抗 + 三抗 （PAP，APAAP）,1）單橋法抗原 + 一抗 + 二抗（橋抗體）+ 三抗（抗酶抗體）底物顯色,2） 雙橋法 在三抗之后，將二抗和三抗再重復(fù)一次，可增大染色強(qiáng)度。 ★ 特別提示：注意動(dòng)物種屬關(guān)

27、系的一致性。 （4）葡萄球菌A蛋白法（5）ABC法、SABC、Envision…,2 免疫組化染色基本技術(shù),（1）抗體稀釋度 1）工作液--- 2） 原液--- 預(yù)實(shí)驗(yàn) 3） 抗體濃度選擇---- 控制一定濃度范圍 （2）抗體滴片技術(shù) （3）PBS洗滌 1）目的----- 保證離子濃度、PH、減少

28、非特異反應(yīng) 2）方法,（3）抗體孵育技術(shù) 濕盒、溫度、時(shí)間,二）免疫組化染色注意事項(xiàng)：① pH： 中性及弱堿性 反應(yīng)液和洗滌液： pH 7.2-7.4緩沖液配制② 離子濃度： 低離子濃度： 0.01-0.02mol／L緩沖液③ 去污劑： 0.05％Tween20 0.01% EDTA 0.1％-l％Triton

29、X-100 可分別加入反應(yīng)液和染色前洗滌液內(nèi),④ 抗體稀釋液中蛋白質(zhì)濃度： 減少抗體的非特異性吸附 0.1-0.6％牛血清白蛋白(BSA) 5-10％正常山羊血清 ⑤ 防腐劑： NaN3(0.0l％)---抑制非特異性著色、提高靈敏性 ⑥ 溫度和時(shí)間： ⑦ 濕度 ⑧ 洗滌： 可除去前一步所加的未結(jié)合抗原或抗體，以消除因非特異性染色。 洗滌液中可加入

30、去污劑 振蕩,（六）對照,目的：證明和肯定陽性結(jié)果的特異性。 主要是針對第一抗體對照，常用的對照方法包括： ① 陽性對照； ② 陰性對照； ③ 阻斷試驗(yàn)； ④ 替代對照； ⑤ 空白對照； ⑥ 自身對照； ⑦ 吸收試驗(yàn)。,(一)陽性對照 已知抗原陽性的切片-----陽性對照 待檢標(biāo)本呈陰性結(jié)果時(shí)，陽性對照尤為重要。(二)陰性對照 不含已知抗原的標(biāo)本----陰性對照

31、 空白、替代、吸收和抑制試驗(yàn)都屬陰性對照 待檢標(biāo)本呈陽性結(jié)果時(shí)，陰性對照就更加重要，用以排除假陽性。,準(zhǔn)確判斷陽性和陰性,排除假陽性和假陰性結(jié)果對照實(shí)驗(yàn)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)幾種方法進(jìn)行驗(yàn)證,（七）免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果的判斷,特異性染色與非特異性染色的鑒別點(diǎn) 特異性染色表現(xiàn)： 常分布于特定的部位, 即具有結(jié)構(gòu)性。 在同一切片上呈現(xiàn)不同程度的陽性染色結(jié)果。 非特異性染

32、色表現(xiàn)： 無一定的分布規(guī)律,常為成片的均勻著色； 細(xì)胞和周圍的結(jié)締組織均無區(qū)別的著色,或CT呈現(xiàn)強(qiáng)染； 切片的邊緣、刀痕、組織折疊部位易出現(xiàn)。非特異性和特異性染色同時(shí)存在： 過強(qiáng)的非特異性染色背景,1陽性細(xì)胞的染色特征(1)陽性細(xì)胞染色分布為灶性和彌漫性，三種類型： ① 胞漿：大部分抗原見于細(xì)胞漿 ② 細(xì)胞核 ③ 細(xì)胞膜表面 (2)細(xì)胞內(nèi)含抗原量不同

33、 染色強(qiáng)度不一(3）陽性細(xì)胞與陰性細(xì)胞相互交雜分布;(4)相同的陽性染色強(qiáng)度,不能用于判斷陽性。 如：切片邊緣、刀痕、皺折區(qū)； 壞死或擠壓的細(xì)胞區(qū)； 結(jié)締組織等,,,結(jié) 束,,,2） 雙橋法 在三抗之后，將二抗和三抗再重復(fù)一次，可增大染色強(qiáng)度?！?特別提示：注意動(dòng)物種屬關(guān)系的一致性。 （4） PAP法（過氧化物酶－抗過氧化物酶法Peroxidase anti-peroxida

34、se method, PAP法） PAP法是橋法的改良，基本原理與橋法相同，只是酶（HRP）和抗酶抗體先制成免疫復(fù)合物（PAPcomplex），既抗原－抗體－抗IgG抗體－PAP復(fù)合物，代替橋法中的抗酶抗體和隨后與酶結(jié)合，把兩個(gè)步驟合并為一步。 該法簡化了操作步驟，提高了靈敏度，所染標(biāo)本可長期保存。,（5） ABC法（親和素－生物素－過氧化物酶復(fù)合物法，Avidin-biotin-peroxidase Complex meth

35、od，ABC法）Avidin: 親和素，一種糖蛋白，其上有四個(gè)與生物素相結(jié)合的位點(diǎn)。Biotin：生物素－維生素H，兩者親和力巨大，牢不可破。ABC法與PAP法的區(qū)別是：以ABC復(fù)合物代替PAP復(fù)合物。 1）ABC復(fù)合物的制備：,2）ABC法反應(yīng)原理,（6）SP或SAP法（過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白 素或過氧化物酶標(biāo)記的堿性磷酸酶染色 Streptavidin/peroxidase or strep