酚氯仿異丙醇抽提核酸的一些問(wèn)題

1、酚：氯仿：異丙醇抽提核酸的一些問(wèn)題酚：氯仿：異丙醇抽提核酸的一些問(wèn)題201401423:191.異丙醇和乙醇沉淀質(zhì)粒的區(qū)別異丙醇和乙醇沉淀質(zhì)粒的區(qū)別：異丙醇和酒精都是有機(jī)溶劑，一般來(lái)講，提取質(zhì)粒的時(shí)候一開(kāi)始都要用異丙醇沉淀，因?yàn)楫惐汲恋淼男Ч靡恍?，但最后大多用酒精沉淀，因?yàn)榫凭菀讚]發(fā)，對(duì)下游的實(shí)驗(yàn)影響小。異丙醇比較疏水，能很更好地沉淀核酸，用乙醇的目的是去鹽，它比異丙醇更親水，所以能去掉一些鹽離子。有時(shí)還用70%的乙醇洗樣品也是

2、為了增加鹽的溶解度。在沉淀核酸時(shí)可用乙醇與異丙醇，乙醇的極性要強(qiáng)于異丙醇，所以一般用2倍體積乙醇沉淀，但在多糖、蛋白含量高時(shí)，用異丙醇沉淀可部分克服這種污染，尤其用異丙醇在室溫下沉淀對(duì)擺脫多糖、雜蛋白污染更為有效。異丙醇沉淀核酸時(shí)，高濃度鹽存在將使大量多糖存在溶液中，從而可達(dá)到去多糖的作用。但高濃度的鹽存在會(huì)影響核酸的進(jìn)一步操作，因此必須用乙醇多次洗滌脫鹽。異丙醇異丙醇：優(yōu)點(diǎn)為所需容積小且速度快，適用于濃度低，而體積大DNA樣品的沉淀。

3、0.54~1.0倍體積的異丙醇可選擇性沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA；但對(duì)5sRNA、tRNA和多糖產(chǎn)物不產(chǎn)生沉淀，一般不需要在低溫條件下長(zhǎng)時(shí)間放置。缺點(diǎn)：易使鹽類（如NaCl、蔗糖）與DNA共沉淀；在DNA沉淀中異丙醇難以揮發(fā)除去，所以常規(guī)需要用70％的乙醇漂洗DNA沉淀數(shù)次。乙醇：乙醇：沉淀DNA乙醇是首選的有機(jī)溶劑，對(duì)鹽類沉淀少，DNA沉淀中所含的衡量乙醇易蒸發(fā)去處，不影響以后的實(shí)驗(yàn)。在適當(dāng)?shù)柠}濃度下，2倍樣品容積的95％乙

4、醇可有效沉淀DNA，對(duì)于RNA則需要將乙醇量增加至2.5倍缺點(diǎn)是總體積較大。需在20放置很長(zhǎng)時(shí)間，30分鐘1小時(shí)。同樣需要70%乙醇洗滌。2.一般用的是酚：氯仿：異丙醇為酚：氯仿：異丙醇為25：24：1（vv），其中酚是強(qiáng)烈的蛋白質(zhì)變性劑，能有效使蛋白質(zhì)變性而除去，氯仿有強(qiáng)烈的脂溶性，去除脂類雜質(zhì)，3.本身酚：氯仿：異戊醇=25：24：1的主要作用是抽提蛋白質(zhì)步驟：質(zhì)粒用等體積等體積的酚氯仿異丙醇抽提一次，重復(fù)此步驟，加入兩倍體積的無(wú)水

5、乙醇和110體積的3molL氯仿：克服酚的缺點(diǎn)；加速有機(jī)相與液相分層。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的跡量酚。（酚易溶于氯仿中）用酚－氯仿抽提細(xì)胞基因組用酚－氯仿抽提細(xì)胞基因組DNA時(shí)，通常要在酚時(shí)，通常要在酚氯仿中加少許異戊醇，為什么？氯仿中加少許異戊醇，為什么？異戊醇：減少蛋白質(zhì)變性操作過(guò)程中產(chǎn)生的氣泡。異戊醇可以降低表面張力，從而減少氣泡產(chǎn)生。另外，異戊醇有助于分相，使離心后的上層含DNA的水相、中間的變性蛋白相及下層有機(jī)溶劑相維

6、持穩(wěn)定。用乙醇沉淀用乙醇沉淀DNA時(shí)，為什么加入單價(jià)的陽(yáng)離子？時(shí)，為什么加入單價(jià)的陽(yáng)離子？用乙醇沉淀DNA時(shí)，通常要在溶液中加入單價(jià)的陽(yáng)離子，如NaCl或NaAc，Na中和DNA分子上的負(fù)電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，而易于聚集沉淀。原理原理：動(dòng)物和植物組織的脫氧核糖核蛋白（DNP）可溶于水或濃鹽溶液（如1molL氯化鈉），但在0.14molL氯化鈉鹽溶液中溶解度最低，而核酸核蛋白（RNP）則在0.14molL氯化鈉中溶解度

7、最大，利用這一性質(zhì)可將其分開(kāi)。將沉淀物溶解于生理鹽水，加入去污劑十二烷基硫酸鈉（SDS）溶液，使DNA與蛋白質(zhì)分離開(kāi)。加入固體氯化鈉使其濃度達(dá)到1molL，使DNA溶解。加氯仿異戊醇去除蛋白質(zhì)，也可重復(fù)該步操作得較純DNA。最后用95%乙醇沉淀DNA。溶解溶解：將離心后除去RNA的沉淀，用30ml生理鹽水溶解，充分?jǐn)嚢韬?，勻漿一次。加4毫升10％SDS溶液，使溶液的SDS濃度達(dá)到1％左右，邊加邊攪拌，放置60℃水浴保溫10分鐘（不停攪拌

8、），冷卻。加固體氯化鈉，使溶液氯化鈉濃度達(dá)到1molL，充分?jǐn)嚢?0分鐘；除雜質(zhì)除雜質(zhì)：加等體積氯仿異戊醇混合液，充分震蕩10分鐘，8000rmin離心7分鐘，取上層液，量好體積，倒入燒杯中（離心管），加同體積的氯仿異戊醇混合液，重復(fù)上次操作。直至界面不出現(xiàn)蛋白凝膠為止；沉淀沉淀：準(zhǔn)確量取上清液體積，加2倍體積95％冷乙醇，攪拌后，置冰箱靜止冷卻，待有白色絲狀物出現(xiàn)，約1015分鐘，離心8000rmin離心7分鐘，得白色沉淀；溶解溶解：