ctc檢測(cè)技術(shù)

1、外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)技術(shù),第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院張曉麗,ASCO Annual Report ：2015 臨床腫瘤學(xué)進(jìn)展液體活檢引領(lǐng)未來十年腫瘤治療,液體活檢樣本之CTCs,CTCs的概念,1896年Ashworth患者外周血中發(fā)現(xiàn)與原發(fā)腫瘤細(xì)胞體積和形態(tài)相似的細(xì)胞目前CTCs定義為自發(fā)或因診療操作脫離實(shí)體瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶進(jìn)入外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞在腫瘤轉(zhuǎn)移灶形成前即可在外周血中檢測(cè)到循環(huán)腫瘤細(xì)胞,Ashworth TR.

2、Aust Med J, 1869, 14: 146-147Allard WJ, et al. Clin Cancer Res, 2004, 10: 6897-6904,循環(huán)腫瘤細(xì)胞的特性,Wu et al.Clin Chem Lab Med 2013, 10.1515Allard, W. J. et al. Clin Cancer Res 2004;10:6897-6904,循環(huán)腫瘤細(xì)胞的特性,Mego, M, Nat. Rev.

3、Clin. Oncol.2010,細(xì)胞表面抗原標(biāo)志物表達(dá)差異攜帶不同的分子信息轉(zhuǎn)移潛力差異,異質(zhì)性,循環(huán)腫瘤細(xì)胞的特性,Bednarz-Knoll,et al. Cancer Metastasis Rev (2012) 31:673–687,CTCs可以是間質(zhì)型、上皮型、上皮間質(zhì)混合型、成團(tuán)的CTCs(CTM),Breast Cancer：N Engl J Med 351:781-791,2004Prostate Canc

4、er : Lancet Oncol 10:233-239, 2009Colorectal Cancer: J Clin Oncol 26:3213-3221, 2008,CTC對(duì)于無進(jìn)展生存期與總生存期的有效預(yù)測(cè),,CTCs檢測(cè)的臨床可行性,如何檢測(cè)CTCs？CTCs的富集：如何獲取CTCs？ 每10mL血液中可能僅含有幾個(gè)到幾十個(gè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞，而10mL血液中含有的白細(xì)胞約有1億個(gè)，紅細(xì)胞有500億個(gè)。 ※從紅細(xì)胞和

5、白細(xì)胞中富集惡性腫瘤細(xì)胞CTCs的鑒定：如何鑒定所獲細(xì)胞為CTCs？ ※將惡性腫瘤細(xì)胞與紅細(xì)胞、白細(xì)胞、正常上皮細(xì)胞、造血干細(xì)胞等區(qū)分開來,循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè),CTCs檢測(cè)技術(shù),Harouaka R, Kang Z, Zheng SY, et al. Pharmacol Ther. 2014 Feb;141(2):209-21.,CTCs的檢測(cè)方法及代表技術(shù)產(chǎn)品,免疫捕獲法——磁珠分選,原理： 將特異性抗原包被在已有同源二

6、抗的磁珠上制成免疫磁珠再與靶細(xì)胞上抗抗原結(jié)合成“靶細(xì)胞—抗原抗體—磁珠”復(fù)合物，在磁場(chǎng)作用下向一定方向移動(dòng)，從而富集靶細(xì)胞.分選策略陽性富集：使用表面耦聯(lián)抗目的細(xì)胞抗體的磁珠，細(xì)胞與磁珠結(jié)合后直接在磁場(chǎng)中被分離出來。負(fù)性篩選：通過去除無關(guān)細(xì)胞使目的細(xì)胞得以純化,陽性富集,CellsearchTM系統(tǒng)/CTC芯片（CTC-chip）/MACS®Cell Separation 磁性細(xì)胞分選系統(tǒng)原理： 采用抗EpCAM

7、（CD326）結(jié)合免疫磁珠捕獲EpCAM陽性CTCs特點(diǎn)： 捕獲的CTCs純度較高 能夠捕獲到血液中上皮型、上皮間質(zhì)混合型的CTCs 無法捕獲到間質(zhì)型CTCs（EpCAM陰性）,,magnet,Anti-EpCAM Coated ferrofluids,7.5ml,,,Anti-CK (epithelial cells)Anti-CD45 (WBCs)DAPI (viable cells

8、 ),Automated fluorescence detection system,使用抗EpCAM抗體抗體包被磁微粒，使其與腫瘤細(xì)胞結(jié)合，在特定磁場(chǎng)作用下達(dá)到分離CTC的目的。,陽性富集-CellsearchTM,CellsearchTM CTCs鑒定,CTCs的判定：DAPI（細(xì)胞核）陽性、角蛋白CKs陽性、CD45陰性,Cellsearch在各癌種中的檢出率,芯片的表層排布了78 000個(gè)包被抗 EpCAM抗體的微位點(diǎn)

9、血液樣本流經(jīng)芯片時(shí)，抗體與腫瘤細(xì)胞結(jié)合粘附在芯片上,陽性富集- CTCs-Chip,原理：聯(lián)合上皮細(xì)胞標(biāo)志及腫瘤特異性標(biāo)志通過免疫磁珠分選特異性腫瘤的CTCs聯(lián)合抗MUC1和EpCAM抗體檢測(cè)乳腺癌和直腸癌通過RT-PCR擴(kuò)增腫瘤標(biāo)志物來鑒定CTCs特點(diǎn)：較單一使用EpCAM抗體更特異不適用于EpCAM和CK陰性或弱化的CTCsPCR鑒定敏感性高，但易造成假陽性,陽性富集- Adna Test 檢測(cè)系統(tǒng),免疫捕獲技術(shù)缺陷（

10、一代技術(shù)）,陰性富集,Cyttel/Cytelligen 檢測(cè)系統(tǒng)原理: 利用CD45磁珠抗體吸附白細(xì)胞，在磁場(chǎng)作用 下去除白細(xì)胞，CTCs被富集沉淀特點(diǎn)： 可檢出EpCAM、CK陰性的間質(zhì)型CTCs 樣本處理步驟多，CTCs易丟失,陰性篩選法--Cyttel,步驟較多，CTCs容易丟失,鑒定不穩(wěn)定,判定標(biāo)準(zhǔn)：DAPI陽性、CD45陰性，8號(hào)染色體擴(kuò)增；特異性不足,基于細(xì)胞大小過濾,原理：根據(jù)腫瘤細(xì)胞的體積大于

11、白細(xì)胞體積分離CTC代表技術(shù)：濾膜濾法分離上皮源腫瘤細(xì)胞（ISET）方法：將全血經(jīng)過帶小孔8μm的聚碳酸酯膜的過濾，即可除去白細(xì)胞 富集得到CTCs.特點(diǎn)：細(xì)胞完整性好；可完全分離上皮型、間質(zhì)型CTCs；可檢出循環(huán)腫瘤拴子；局限：不宜檢出細(xì)胞直徑小于8μm的腫瘤如神經(jīng)內(nèi)分泌瘤,HepG2 cells stained with anti-KL1,濾膜法,密度梯度離心,原理： 根據(jù)腫瘤細(xì)胞與白細(xì)胞密

12、度不同，通過梯度離心分離CTCsOncoQuick分離體系方法： 密度梯度離心后，白細(xì)胞通過多孔濾膜被濾除，而CTCs被富集在介 質(zhì)層中，洗脫后得到CTCs.特點(diǎn)：可分離CK陽性和陰性細(xì)胞局限性：CTCs遷移可能至血漿層、紅細(xì)胞層和粒細(xì)胞層而丟失；CTCs微栓子可能沉入紅細(xì)胞層而丟失；與腫瘤細(xì)胞特性、離心時(shí)間和溫度等有關(guān)；用血量多15-30ml,流式細(xì)胞術(shù),原理：根據(jù)白細(xì)胞表達(dá)CD45抗原、CK陽性CTCs

13、表達(dá)EpCAM，采用不同熒光素標(biāo)記的抗CD45和抗EpCAM，通過流式細(xì)胞術(shù)分析和分選CK陽性細(xì)胞的CTC（CD45- EpCAM+）可在檢測(cè)的同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)、DNA倍數(shù)分析敏感性較低，需要的血液樣本量大缺乏規(guī)范的臨床操作方法,常見CTCs一代檢測(cè)技術(shù)的比較,臨床實(shí)踐亟需新技術(shù)實(shí)現(xiàn)CTCs分離、分型、分析,先分離后鑒定，采用上皮+間質(zhì)標(biāo)志物進(jìn)行鑒定，不同表型的CTC均能檢出。,技術(shù)原理,CanPatrolTM-CTCs高效捕

14、獲,數(shù)據(jù)更新至2015-01,同步實(shí)現(xiàn)CTCs鑒定與分型,CTCs精準(zhǔn)分型深入評(píng)估復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn),間質(zhì)型CTCs轉(zhuǎn)移能力比上皮型、混合型CTCs強(qiáng)CTM的轉(zhuǎn)移成瘤能力是單個(gè)CTCs的20-50倍,：CTCs的全面深入分析,：CTCs的全面深入分析,,,,,：CTCs全基因組測(cè)序,CanPatrolTM 技術(shù)特點(diǎn)和創(chuàng)新,CanPatrolTM二代CTC檢測(cè)技術(shù),高效分離所有類型CTCs采用特制納米濾膜，且不依賴于特定的上皮標(biāo)志物，可高效

15、、全面分離所有類型CTCs適用于絕大多數(shù)實(shí)體瘤采用國際公認(rèn)8μm孔徑濾膜法截留CTCs，適用于絕大多數(shù)實(shí)體瘤最大程度保留原始信息：物理法（過濾）使CTCs形態(tài)及分子信息保存完整，利于深入分析唯一實(shí)現(xiàn)分型分析的CTC檢測(cè)技術(shù)：高靈敏度RNA-ISH技術(shù)，結(jié)合上皮、間質(zhì)兩組特異性RNA探針，實(shí)現(xiàn)CTCs精準(zhǔn)分型,CTCs檢測(cè)技術(shù)小結(jié),基于免疫捕獲原理（如以EpCAM等抗體進(jìn)行陽性篩選）的技術(shù)，富集獲得的CTC純度較高，但多項(xiàng)研究

16、均發(fā)現(xiàn)該類方法很容易漏掉那些最具有侵襲潛能的腫瘤細(xì)胞（間質(zhì)型CTCs及CTM）；陰性篩選法鑒定不穩(wěn)定，不能進(jìn)行分型，同樣會(huì)發(fā)生CTCs丟失；密度梯度離心法也會(huì)發(fā)生CTCs及CTM的丟失；研究證明ISET法對(duì)間質(zhì)型CTCs 及CTM的富集效果比免疫捕獲法好。ISET法亦會(huì)丟失CTCs，主要是直徑小于濾膜孔徑的CTC，和存活狀態(tài)不好甚至是因凋亡而萎縮的CTCs，因此其丟失的大部分CTC是侵襲性較弱的。 ISET法的另一個(gè)不足是獲